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激光扫描共聚焦显微镜观察反义核酸探针的细胞摄取及分布
目的 采用激光共聚焦显微镜,观察荧光标记的反义寡核苷酸探针在细胞的摄取和细胞内分布.并评价阳离子脂质体载体对提高细胞摄取的作用.方法 合成针对人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)第1723-1741密码子的18个碱基的反义寡核苷酸探针,在3末端连接荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC).转hTERT的胎儿神经前体细胞hNPCs-G3作为实验细胞.阳离子脂质体作为反义探针载体.激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光分布并测定荧光强度.结果 无脂质体介导的对照组细胞荧光强度很低,荧光主要分布在细胞膜,细胞浆和细胞核荧光强度低于细胞膜.脂质体介导的实验组细胞荧光强度显著增加,细胞核荧光强度显著高于细胞膜,两者的荧光强度差异有显著意义(P＜0.01).结论 无载体的反义探针细胞摄取率较低,细胞膜探针结合较多.脂质体载体可显著提高细胞对探针的摄取,且大部分探针进入细胞核.激光扫描共聚焦显微镜可以清晰显示细胞对探针的摄取及细胞分布,是一种直观有效的研究工具.
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免疫球蛋白基因SNC66和SNC73在正常肠粘膜和大肠癌组织中表达的研究
SNC66基因和SNC73基因是采用减式杂交技术，从正常人大肠粘膜cDNA文库中筛选得到的两个大肠癌负相关基因［1］。为进一步明确免疫球蛋白基因SNC66和SNC73在正常大肠粘膜和大肠癌组织中的表达情况，了解它们的生物特性［2，3］，我们采用cRNA/mRNA原位杂交技术，对这2个基因在大肠癌组织及同一患者的正常粘膜中的表达情况作了配对研究，观察它们在正常粘膜与肿瘤之间，以及粘膜上皮与间质或淋巴组织之间的表达情况，以明确此两基因与大肠癌的相关性。 1．材料与方法：浙江大学医学院附属第二医院手术切除的大肠癌标本及同一患者相应的正常大肠粘膜组织共收集37例。其中男性26例，女性11例，中位年龄57岁。其中29例临床病理资料完整。探针的制备及原位杂交：用SNC66基因和SNC73基因的在IgA1同源区的部分序列，构建出重组质粒pGEM7SNC66和pGEM7SNC73，各合成出地高辛标记的一对cRNA探针，其中之一为与目标mRNA互补的有效的反义探针，作为实验探针；另一为与目标mRNA同序的正义探针，作对照探针。配对材料进行原位杂交［4］，在光学显微镜下观察，紫蓝色为阳性信号。统计学处理采用χ2检验。
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99mTc标记c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对乳腺癌显像的实验研究
用放射性核素标记癌基因反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)对肿瘤进行显像,可以探测只有癌基因激活、扩增和过度表达还没有形成实体的肿瘤组织,以实现对肿瘤的早期诊断[1,2].乳腺癌是妇女发病率和死亡率高的主要恶性肿瘤[3],如果能在肿瘤早期鉴别其癌基因的表达类型及临床分期,施行"量体裁衣"式的治疗,可提高乳腺癌治疗的效果.c-erbB2是乳腺癌原癌基因,与乳腺癌的恶性转化和不良预后密切相关[4].本课题以c-erbB2为靶基因,设计一段15 mer与目的基因mRNA互补的反义寡脱氧核苷酸,用放射性核素锝(99mTc)标记,与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)联接,得到反义探针.探针获得受体/配体特异结合的导入特性,通过肿瘤细胞膜上表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的介导进入细胞,增加寡核苷酸的细胞摄取率.本文拟对反义探针在荷瘤小鼠体内的组织分布,以及对癌基因过度表达肿瘤组织的显像进行研究.
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Gd-DOTA-hTERT ASON磁共振肿瘤端粒酶靶向显像实验研究
背景与目的：研究表明，约有超过85%的恶性肿瘤高表达端粒酶活性。因此，端粒酶已成为肿瘤诊断和治疗研究领域的热点之一。目前，以放射性核素标记人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide，hTERT ASON)对高表达hTERT的恶性肿瘤进行靶向显像在国内外也有相关报道，但核医学图像在解剖和空间分辨率上存在着不足，难以获得高质量的图像。因此，本研究拟以磁共振成像方法对活体内肿瘤端粒酶的进行检测，并对其进行可行性评价。方法：以DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid)为螯合剂对全链硫代修饰的hTERT ASON(3’末端连接一个伯氨)进行Gd3+标记制备反义探针并进行体外实验，以99mTc标记的DOTA-hTERT ASON生物分布实验；建立人黑色素瘤A375裸鼠模型，分别于腹腔注射前及注射后0.5、1、2、4、6、24 h在7.0T Magnetic Resonance Imaging(MRI)下行T1WI显像，以肿瘤及其周围正常组织作为感兴趣区(region of interest，ROI)计算信噪比(signal to noise ratio，SNR)并与Gd-DTPA进行比较；显像后48 h处死小鼠，以免疫组织化学方法检测肿瘤组织端粒酶活性。结果：Gd-DOTA-hTERT ASON的标记率约为65%，在37℃新鲜人血清中温育24 h后，探针的降解率低于3%；A375细胞对探针的摄取约为8.5%，Gd-DOTA-hTERT ASON转染的A375细胞信号强度明显高于Gd-DTPA和DOTA-hTERT ASON组；肿瘤在注射反义探针和Gd-DTPA均表现为明显强化，反义探针组SNR高可达2.37，大强化时间为注射后2~6 h，且可被DOTA-hTERT ASON所抑制(P＜0.05)，而Gd-DTPA组强化时间为注射后2 h；Gd-DOTA-hTERT ASON可抑制肿瘤端粒酶活性。结论：Gd-DOTA-hTERT ASON显示了良好的肿瘤靶向性，对端粒酶阳性表达的肿瘤具有潜在的定性诊断价值。
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99Tcm标记反义肽核酸探针的制备及其荷瘤裸鼠体内分布
目的 探讨99Tcm标记反义肽核酸(PNA)探针的新方法及其在生物体内的分布.方法 合成12mer且5'端含有四肽G-(D)-A-G-G的c-myc mRNA反义、无义PNA片段,利用G-(D)-A-G-G形成的N4结构为螯合基团进行99Tcm标记,用聚酰胺薄膜层析法和高效液相色谱仪法(HPLC)测定其标记率和标记物的稳定性,并行人结肠癌荷瘤裸鼠体内分布[每克组织百分注射剂量率(%ID/g)]及显像研究.采用SAS 6.22软件对数据进行分析.结果 反义、无义PNA片段合成物的纯度>95%.99Tcm标记c-myc mRNA反义、无义PNA的标记率>95%,标记物室温放置18 h测定其标记率仍可达95%以上.c-myc mRNA反义、无义PNA片段4～8℃下放置3个月标记率仍>95%.HPLC测定标记物呈单峰.99Tcm标记c-myc mRNA反义PNA主要分布在荷瘤鼠肾、脾、肿瘤、肠道、肝组织中,99Tcm标记c-myc mRNA无义PNA在荷瘤鼠血液、脾、肾、肝及肺组织中分布较多;注射后4 h两者在荷瘤鼠肿瘤组织中的分布差异有统计学意义[(1.11±0.12)%ID/g和(0.14±0.02)%ID/g;t=14.75,P<0.01].99Tcm标记c-mycmRNA反义PNA在小鼠体内肿瘤/肌肉、肿瘤/肺的摄取比值较高,肿瘤显像明显.结论 用99Tcm标记c-myc mRNA反义、无义PNA的方法简单,标记率高,标记物稳定,前者有望成为一种新型肿瘤显像剂.
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SPIO标记的c-erbB2反义探针用于活体荷瘤裸鼠MRI的佳扫描浓度
目的 探讨SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针用于活体荷瘤裸鼠MRI的佳扫描浓度.方法 BALB/c荷瘤裸鼠30只,随机分为5组并每组注射不同浓度反义探针(含Fe 6.0、9.0、12.0、15.0、18.0 mg/kg),每组裸鼠于既定的时间点(注射前、注射后360 min)同步行MRI扫描.在完成MR扫描后,立即处死荷瘤裸鼠,取出肿瘤组织,行HE及普鲁士蓝染色,光学显微镜下观察；测量肿瘤组织在注射不同浓度反义探针前后的信号强度变化.结果 成功建立荷瘤裸鼠模型,成瘤率100％.6.0、9.0及12.0 mg组裸鼠注射探针后均存活,但15.0 mg组及18.0 mg组注射探针及扫描完成后存在部分裸鼠死亡；对比荷瘤裸鼠肿瘤组织在不同浓度反义探针注射前后的信号强度变化,发现12.0、15.0及18.0 mg组裸鼠在注射探针后,肿瘤组织信号强度变化更具显著性(P＜0.001)；肿瘤组织信号强度均明显变化并可达到明显肉眼辨识水平,在MR扫描图像上能够清楚显示,并且12.0 mg组、15.0 mg组及18.0 mg组的统计学差异无显著性(P＞0.05).HE染色发现肿瘤组织结构紊乱,存在大量异性肿瘤细胞,排列呈“癌巢”状,在各浓度组表现相似；而普鲁士蓝染色发现各浓度组的肿瘤组织标本中均散在分布斑点状蓝色铁颗粒,12.0 mg组、15.0 mg组及18.0 mg组分布均密集明显.结论 SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针能靶向于肿瘤组织,用于BALB/c裸鼠MRI的佳扫描浓度为含Fe 12.0 mg/kg.
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SPIO标记的c-erbB2反义探针用于活体荷瘤裸鼠MR的佳扫描时间探讨
目的 探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针用于活体荷瘤裸鼠MR的佳扫描时间.方法 荷瘤裸鼠30只,注射反义探针(12.0 mg Fe/kg)并于不同时间点(注射前,注射后60 min、180 min、360 min、720 min及1 440min)同步行MRI扫描.在完成一个时间点扫描后,立即处死荷瘤裸鼠5只,取出肿瘤组织,行HE及普鲁士蓝染色,光学显微镜下观察；测量肿瘤组织及邻近肌肉组织各时间点信号强度.结果 成功建立荷瘤裸鼠模型,成瘤率100％.对比荷瘤裸鼠在反义探针注射前后的不同时间点扫描的信号强度,发现肿瘤组织在注射后360 min信号变化明显,在MR扫描图像上能清楚显示.HE染色发现肿瘤组织结构紊乱,存在大量异性肿瘤细胞,排列呈“癌巢”状,在各时间点表现相似；而普鲁士蓝染色发现各观察时间点标本的肿瘤组织中均散在分布斑点状蓝色铁颗粒,以注射反义探针后360 min分布密集.结论 SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针能靶向于肿瘤组织,用于BALB/c裸鼠MR的佳扫描时间为注射后360 min.
