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牛脱细胞肌腱基质的制备方法研究
目的：：探究牛肌腱组织脱细胞的方法,为组织工程法修复肌腱所需生物材料的制备提供理论和实验基础。方法：牛的肌腱作实验材料,被组织粉碎机粉碎后,依次放入不同浓度的胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浸泡处理后,所得基质用过氧乙酸-乙醇溶液中灭菌消毒处理,然后依次用蒸馏水和PBS缓冲液洗涤、过滤。后冷冻、干燥、保存。冰冻切片进行苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况。微量DNA提取试剂盒提取脱细胞后跟腱基质DNA,检测DNA的残留量。结果：大体观察可见,各实验组跟腱组织经脱细胞处理后,均呈乳白色匀浆状。苏木素-伊红染色结果显示,跟腱组织脱细胞处理后细胞核均大量减少,细胞核残留极少,每高倍视野中细胞核残留不大于5。 DNA含量结果显示,当牛跟腱组织依次经过0.5%胰蛋白酶溶液处理2 h、1%的Triton X-100溶液处理2 h、0.5%的SDS溶液处理1 h后,得到的肌腱脱细胞基质DNA含量少,为0.03μg/mg。结论：依次用胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浓度分别为0.5%、1%、0.5%、处理时间分别为2h、2h、1h时,对牛肌腱组织的脱细胞效果佳。
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移行结构化细胞-肌腱复合物重建韧带-骨连接体的实验研究
目的 观察体外构建的具有连续异质性移行结构的细胞-肌腱复合物重建兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)在动物体内的愈合效果.方法 通过胶原水凝胶将异质性细胞群种植于脱细胞兔跟腱支架内特定的区域,构建一种具有纤维形成、软骨形成及骨形成3个功能区域的细胞-肌腱复合物重建兔ACL,8周后进行组织学、显微CT、免疫荧光分析检测移植物与骨隧道间预先设定区域内特定组织的梯度形成情况.结果 组织学及免疫荧光结果显示,软骨标志物GAG、COL2A1只在软骨段内生成,而骨标志物钙结节、OCN只在成骨段内生成,关节腔内纤维生成段内新生的胶原纤维相互连接,有效地修复了支架的胶原结构.显微CT结果显示,与对照组相比,实验组骨隧道腔内大量新生矿化组织形成.该细胞-肌腱复合物重建兔ACL 8周后,在骨隧道-关节腔界面表现出纤维-纤维软骨-骨的结构渐变现象.结论 该细胞-肌腱复合物重建兔ACL,骨隧道-肌腱界面愈合良好,微观结构与生理性ACL-骨界面极其相似,有望应用于ACL的损伤后重建.
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脱细胞小牛肌腱组织形态学和生物力学特性研究
目的 研究反复冻融结合核酸酶处理小牛肌腱脱细胞效果以及对肌腱组织形态、结构、生化成分和力学特性的影响. 方法 取新鲜1日龄西门塔尔小牛跟腱48根,随机分为3组(n=16):A组为正常对照组,B组采用液氮冷冻/37℃复温反复冻融5次,C组在反复冻融基础上结合核睃酶处理24 h.每组取2根跟腱用于扫描电镜观察,3根用于、组织学及免疫组织化学染色观察,3根用于DNA残留量检测,8根用于生物力学检测. 结果 扫描电镜观察示A、B组胶原纤维排列致密有序,形态完整,未见断裂;C组胶原纤维排列松散,几乎无断裂.阿利新蓝、天狼星红染色及免疫组织化学染色示C组糖胺聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白大部分被保留;HE染色和DAPI染色示A、B组胶原纤维间可见较多完整的细胞核,而C组胶原纤维之间未见完整细胞核,但腱内膜上仍有部分细胞核残留.A、B、C组的DNA残留量分别为(0.24±0.12)、(0.16±0.07)、(0.05±0.02)μg/mg,C组显著低于A、B组(P＜0.05)；A、B组间差异无统计学意义(P＞0.05).生物力学检测显示,A、B、C组间拉伸强度、断裂应变、刚度和弹性模差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 反复冻融结合核酸酶处理小牛肌腱,可有效去除细胞成分,同时基本保留肌腱原始胶原纤维结构、形态、大部分细胞外基质成分和力学特性.
