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YST鉴定卡与焦磷酸测序鉴定酵母样真菌的应用评价
目的 评价Vitek2 Compact YST鉴定卡与焦磷酸测序分析鉴定临床分离酵母样真菌的能力.方法 采用Vitek2 Compact YST鉴定卡和焦磷酸ITS1区测序分析回顾鉴定了2011年度济南军区总医院临床分离的酵母样真菌.焦磷酸测序法不能鉴定到种的菌株用Sanger法ITS1区测序复核.YST与焦磷酸测序鉴定结果不一致的菌株用API 20C复核.结果 分离自本院2011年临床送检的各类微生物培养标本的酵母样真菌共282株.ITS1区反向焦磷酸测序分析除3株只能鉴定到相似菌种外,其余菌株均能明确鉴定到种,且与其代表参照序列的同源性均为100％.焦磷酸测序法未能鉴定到种的3株菌,Sanger法测序分析仍然不能完全区分.YST卡未能鉴定的有7株,低分辨率(即鉴定百分率＜80％)的有14株,另有6株鉴定错误,鉴定符合率为90.4％,不同种类的酵母样真菌YST卡的鉴定符合率不同.结论 焦磷酸测序法ITS1区反向测序分析能够完成绝大多数临床分离酵母样真菌的菌种鉴定;Vitek 2 Compact YST卡鉴定基本满足了临床工作需要,但要注意规范标准操作,定期进行室内质控.对一些少见菌种还需结合其分离部位、菌落及菌体特点等综合判断其鉴定结果正确与否.
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细菌rDNA分类鉴定的方法学研究
目的研究细菌rDNA快速鉴定方法.方法以细菌16S rDNA、16S-23S rDNA基因间隔区(ISR)和常见细菌耐药基因为对象,通过改进标本中细菌DNA提取方法,指纹分析、直接测序与多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立快速细菌分子鉴定方法.结果细菌属种不同表现出独特的16S-23S rDNA ISR指纹,在分析软件指导下进行初步细菌鉴定和亲缘关系研究;16S rDNA和16S-23SrDNA ISR序列可确定细菌种与型;序列分析与生化鉴定一致.多重PCR可解决葡萄球菌16S rDNA与mecA基因、产超广谱β内酰胺酶菌16S rDNA与TEM和SHV基因同步检测.结论细菌rDNA分类方法,提高了非培养细菌的鉴定能力.
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ITS和β-微管蛋白基因序列鉴定曲霉菌的临床应用
目的 研究ITS序列分析和β-微管蛋白基因序列分析在曲霉菌鉴定中的临床应用价值.方法 收集2007年7月至2010年1月,首都医科大学附属北京同仁医院真菌性鼻窦炎病原菌株中曲霉菌124株,分别对其进行形态学和分子鉴定.形态学包括传统培养方法、玻片培养和乳酸酚棉蓝染色及KOH消化后显微镜镜检.将菌株的PCR扩增产物进行ITS序列分析和β-微管蛋白基因序列分析,其测序结果与GenBank、European Molecular Biology Laboratory和DNA Data Bank of Japan 3个数据库比对,得到分子鉴定结果.结果 形态学鉴定为黄曲霉的56株曲霉中,经ITS序列分析鉴定为黄曲霉55株,寄生曲霉1株,β-微管蛋白基因序列分析结果与ITS序列分析相同;形态学鉴定为烟曲霉的37株曲霉中,ITS序列分析鉴定为37株烟曲霉复合种,β-微管蛋白基因序列分析鉴定为烟曲霉35株和仑图卢斯曲霉2株;形态学鉴定为杂色曲霉的21株曲霉中,ITS序列分析鉴定为杂色曲霉16株和未鉴定到种的曲霉5株,β-微管蛋白基因序列分析鉴定为杂色曲霉16株和聚多曲霉5株;形态学鉴定为构巢曲霉的10株曲霉中,ITS序列分析和β-微管蛋白基因序列分析均鉴定为构巢曲霉.结论 β-微管蛋白基因序列分析曲霉的分辨率较ITS序列分析高,可以将曲霉准确鉴定到种,ITS序列可以分析到曲霉复合种.
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湖北地区须毛癣菌复合体的分子鉴定
目的：对分离自患者不同部位的须毛癣菌临床株进行种内分型研究，比较不同靶位对须毛癣菌复合体的鉴定效能。方法选取武汉市第一医院皮肤科近3年临床分离的须毛癣菌48株，经形态学观察和尿素酶试验进行表型鉴定。分别以核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）和核糖体大亚基（28S rDNA）D1?D2区为靶位，PCR扩增ITS区和D1?D2区后对产物进行测序，联合应用Clustal X2和MEGA 6.0软件，采用大似然度法进行序列分析并建立遗传进化树。结果 ITS树提示，受试菌株和趾间毛癣菌聚类在同一主支的概率为92%，D1?D2树无法有效区分癣毛癣菌昆克变种和趾间毛癣菌。趾间毛癣菌形态多变，可表现为羊毛型、绒毛型、乳皮型、粉末型和颗粒型。结论 ITS区可将须毛癣菌鉴定到种水平，其鉴定效能优于D1?D2区，形态学方法不能作为其种内鉴定的依据。
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种特异性引物鉴定申克孢子丝菌
目的研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300 bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.
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马尔尼菲青霉临床分离株的rDNA ITS序列分析
目的为设计马尔尼菲青霉种特异性引物,探讨马尔尼菲青霉病更加确切的诊断方法.方法实验菌株为北京大学真菌和真菌病研究中心保存的4株马尔尼菲青霉,来源于国内不同地区.用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增马尔尼菲青霉rDNA ITS,扩增产物纯化后直接测序,测序结果在基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索,并依据序列对比、分析.结果4株临床分离的马尔尼菲青霉的rDNA ITS序列相同.与国外来源于美国、印度尼西亚、法国、澳大利亚的马尔尼菲青霉rDNA ITS序列基本一致.马尔尼菲青霉与荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、念珠菌的rDNA ITS序列差异较大,青霉和曲霉属间rDNA ITS的序列相似性较低,而青霉种间rDNA ITS序列的差异不大.结论不同来源的马尔尼菲青霉菌株间乃至不同青霉的种间的rDNA ITS序列均具有较高的同源性,提示该区可能不适于作为靶基因来设计马尔尼菲青霉的种特异性引物或探针.
