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抗真菌药
其他抗真菌药灰黄霉素Gri seofulvin[抗真菌谱和抗菌作用]灰黄霉素主要对毛发癣菌、小孢子菌、表皮癣菌等浅部真菌有较强的抗菌作用,MIC《1μg/ml.对念珠菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、孢子丝菌属、芽生菌属、球孢子菌属等无作用.
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孢子丝菌病药敏和治疗进展
孢子丝菌病是一种深部真菌病,其致病菌申克孢子丝菌为一种双相真菌,双相真菌的体外药敏试验至今仍无统一标准.饱和碘化钾溶液、伊曲康唑、特比萘芬为治疗孢子丝菌病的常用药物,临床中选择合适的抗真菌药物对治疗此病具有重要意义.体外药敏试验是评价抗真菌药物活性的重要方法,也是选择药物的依据之一.
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申克孢子丝菌酵母相形成过程中转录组表达谱变化及差异表达基因功能分析
目的 比较并分析申克孢子丝菌菌丝相及早期酵母相转录组学的差异,明确酵母相形成过程中转录组表达谱的变化.方法 对25℃沙氏培养基培养96 h获得的菌丝相申克孢子丝菌及37℃脑心浸液培养基培养36 h获得的早期酵母相申克孢子丝菌的转录组进行测序分析,对筛选后的单基因簇进行功能注释,包括与多个数据库(NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO、Pfam)的比对、编码区序列预测及基因在每个样品中的表达量分析.后,对差异表达基因进行模式聚类、功能注释以及富集性分析.结果 共获得14.76 Gb有效数据,组装获得43 863条单基因簇,28 094条获得注释结果.与菌丝相比较,酵母相上调表达的基因10 969条,下调表达的基因199条.差异表达基因参与蛋白磷酸化、细胞内蛋白转运、细胞蛋白修饰、小三磷酸鸟苷酶介导的信号转导、囊泡介导转运、翻译、细胞内信号转导、微管形成、三磷酸腺苷合成偶联质子转运等过程.参与真菌形态形成的两个重要信号转导通路丝裂原活化蛋白激酶和双组分信号通路中的16条基因及参与几丁质合成代谢的16条基因均被证实在早期酵母相上调表达.结论 与菌丝相相比,申克孢子丝菌酵母相基因表达谱发生显著变化,差异表达的基因涉及众多功能,提示孢子丝菌相变受多基因网络系统的调控.
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申克孢子丝菌酵母相对人THP-1巨噬细胞样细胞p38MAPK激活及白细胞介素6表达的影响
目的 探讨申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)巨噬细胞样细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活化及白细胞介素6(IL-6)表达的影响.方法 实时荧光定量反转录PCR分析申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞样细胞3、6h后IL-6 mRNA表达水平变化,酶联免疫吸附法检测刺激24 h后IL-6分泌量;Western印迹法分析2×106 CFU/ml申克孢子丝菌酵母相体外作用于THP-1巨噬细胞样细胞30 min和60 min后p38MAPK磷酸化水平的变化,同时检测100 nmol/L地塞米松(p38MAPK抑制剂)预处理THP-1巨噬细胞样细胞30 min后p38MAPK磷酸化水平及IL-6 mRNA表达水平的变化.采用SPSS19.0统计软件,进行多因素方差分析、单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验.结果 刺激THP-1巨噬细胞样细胞3h后,酵母相组、凝胶多糖组、空白对照组IL-6 mRNA表达水平分别为56.81±7.36、26.69±1.22、0.97±0.05,刺激6h后分别为378.03±16.67、276.24±39.13、1.02±0.04,组间差异有统计学意义(F=5 552.22,P＜0.001).申克孢子丝菌酵母相刺激6h后IL-6 mRNA表达高于刺激3h后(q=16.74,P＜0.001),申克孢子丝菌酵母相与THP-1巨噬细胞样细胞共孵育24 h后,酵母相组、凝胶多糖组及空白组细胞上清液中IL-6浓度分别为(59.96±18.16)、(91.01±17.27)、(5.50±2.30) pg/L,组间差异有统计学意义(F=26.62,P＜0.01);酵母相组高于空白对照组(P＜ 0.01).地塞米松处理后,酵母相组IL-6 mRNA表达水平(4.46±1.03)低于未用地塞米松处理组(493.52±113.87,P＜0.001).申克孢子丝菌酵母相作用THP-1巨噬细胞样细胞30、60 min后,磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量均高于空白对照组(P＜0.01).地塞米松预处理THP-1巨噬细胞样细胞后,磷酸化p38MAPK水平低于未用地塞米松处理组,差异有统计学意义(q=10.81,P＜ 0.01).结论 人THP-1巨噬细胞样细胞体外与申克孢子丝菌酵母相作用后,通过激活p38MAPK信号通路促进IL-6表达.
关键词： 孢子丝菌属 巨噬细胞 白细胞介素6 p38丝裂原活化蛋白激酶类 -
Toll样受体2和4在抗孢子丝菌早期免疫阶段小鼠皮肤中的表达
目的 探讨小鼠皮肤Toll样受体(TLR)2和TLR4在抗孢子丝菌早期免疫阶段的表达.方法 实 时荧光定量PCR检测BALB/c小鼠皮肤早期免疫阶段的TLR2和TLR4 mRNA表达水平,同时通过免疫组化检测两者蛋白表达水平.结果 孢子丝菌分生孢子接种小鼠皮肤后,TLR2 mRNA转录水平在6h后逐渐升高至对照组的18.8倍,24 h达高峰,为对照组的34倍;TLR4 mRNA转录水平在6h内达高峰,为对照组的56.7倍,此后逐渐下降.免疫组化结果显示,孢子丝菌处理组小鼠皮肤角质形成细胞及巨噬细胞均可表达TLR2和TLR4蛋白,对照组不表达.血清中白细胞介素12及肿瘤坏死因子α在实验组和对照组的表达差异无统计学意义.结论 TLR2和TLR4参与了小鼠皮肤角质形成细胞和巨噬细胞对孢子丝菌的识别,有助于免疫防御作用.
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申克孢子丝菌酵母相与白念珠菌诱导中性粒细胞活性氧簇的差异性表达
目的 研究人中性粒细胞吞噬申克孢子丝菌酵母相和白念珠菌后胞内活性氧簇(ROS)的实时表达水平及对两者杀菌能力的差异.方法 应用密度梯度离心法分离人外周血中性粒细胞,并通过ROS探针(DCFH-DA)、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测申克孢子丝菌酵母相临床株和白念珠菌标准株ATCC90028作用后,中性粒细胞内ROS的实时表达水平及对上述2种真菌孢子的杀菌率.结果 申克孢子丝菌酵母相临床株和白念珠菌标准株ATCC 90028作用中性粒细胞60 min后,申克孢子丝菌组中性粒细胞内ROS表达水平达到峰值(平均荧光强度159.67±11.34),并显著高于白念珠菌组(112.22±9.66),经LSD-t检验,P＜ 0.01;而作用120～180 min后,胞内ROS表达水平(120 min为89.01±9.81;180 min为57.63±8.46)迅速下降,显著低于白念珠菌组中ROS的同期表达水平(120 min时为110.25±7.28; 180 min时为109.98±9.00,经LSD-t检验,120 min时P＜0.05,180 min时P＜0.01).激光共聚焦显微镜观察到,ROS主要表达于吞噬上述真菌孢子的中性粒细胞中,并被募集到被吞噬的部分孢子表面.中性粒细胞对申克孢子丝菌180 min杀菌率(19.21％±3.68％)亦显著低于其对白念珠菌孢子的杀菌率(26.63％±4.97％),经LSD-t检验,P＜ 0.01.结论 中性粒细胞吞噬上述2种真菌孢子后,胞内ROS呈明显的差异性表达.与白念珠菌相比,中性粒细胞内ROS水平的迅速下降在一定程度上抑制了其对申克孢子丝菌的杀伤效能.
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以S2-R2为引物PCR检测石蜡切片中的孢子丝菌
R2为引物的PCR适用于孢子丝菌病石蜡切片中病原菌的检测.
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四对孢子丝菌引物的特异性和敏感性评价
目的 筛选对孢子丝菌特异且敏感的引物.方法 以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照,通过特异引物PCR扩增的方法 筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物.所有受试孢子丝菌菌株均出现同一扩增产物,而对照菌株未出现者记为特异性引物,随后将基因组DNA模板倍比稀释后依次行PCR扩增,记录各引物出现阳性扩增结果 时的小模板浓度,检测敏感性.结果 在相同PCR条件下,引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好特异性,而引物SS3-SS4对孢子丝菌及念珠菌菌株均可扩增出同样大小的PCR产物.引物S2-R2的敏感性好,基因组DNA模板浓度为5 pg/μL时即可被检出.结论 针对几丁质合成酶1基因的引物S2-R2为孢子丝菌特异且敏感的引物.
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利用核糖体基因进行申克孢子丝菌基因分型
目的利用探针与DNA印迹法对申克孢子丝菌进行种内分型,探讨其基因型特征与菌种来源及临床表现的关系.方法CTAB法提取来源于不同地区31株孢子丝菌临床分离株及1株标准株的基因组DNA,以真菌通用引物ITS4、NS5扩增标准株的rDNA序列作为探针,与经限制性内切酶Apal酶切后的基因组DNA进行印迹杂交.结果杂交后形成多种清晰而稳定的带型,根据带型将31株孢子丝菌分为15种基因型(A-O型),其中A、B、C三型占51.61%.结论探针与DNA印迹法是孢子丝菌种内分型较为敏感而可靠的方法,该方法所分基因型的不同与菌种的地区来源及临床表现有一定的相关性.
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申克孢子丝菌基因差异、致病力与孢子丝菌病临床型别的关系
目的探讨申克孢子丝菌基因差异、致病力与孢子丝菌病不同临床型别的关系.方法①收集不同临床型别孢子丝菌病的申克孢子丝菌分离株并提取DNA,进行随机扩增多态DNA(RAPD)扩增.②BALB/c小鼠接种不同临床型别孢子丝菌病的分离株菌悬液,观察实验动物发病及病变情况.③发病小鼠皮肤及内脏组织病理学检查,观察接种不同临床型别孢子丝菌病的分离株菌悬液后小鼠病变内申克孢子丝菌孢子数量及分布.结果①不同临床型别孢子丝菌病的申克孢子丝菌分离株聚合酶链反应产物电泳带型差异较明显:播散型分离株可见1 800 bp、850 bp、500 bp、180 bp,皮肤淋巴管型分离株见1 400 bp、800 bp、700 bp、 500 bp,皮肤固定型分离株见2 500 bp、1 400 bp、1 000 bp、700 bp.②注射播散型孢子丝菌病分离株菌悬液的BALB/c小鼠比注射皮肤淋巴管型分离株小鼠发病早、病变部位广且死亡率高;注射皮肤淋巴管型分离株的小鼠较注射固定型孢子丝菌病分离株小鼠皮损出现早、病变范围广且严重.③实验BALB/c小鼠病变皮肤及内脏组织病理学检查显示:注射播散型孢子丝菌病分离株的小鼠病变内孢子数量明显多于注射皮肤淋巴管型分离株小鼠病变内孢子数量,而后者较注射固定型孢子丝菌病分离株的小鼠病变内孢子数量多.结论不同临床型别孢子丝菌病的申克孢子丝菌的基因差异、致病力与孢子丝菌病不同临床型别的关系密切.
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种特异性引物鉴定申克孢子丝菌
目的研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300 bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.
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PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定
目的用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种.方法应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增,扩增产物经ABIPRISMTM 377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小,与对照组--相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照.结果①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同).②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近,差异无显著性.③整个检定过程仅需6 h.结论采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法,结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种,这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法.
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申克孢子丝菌野生株致病性的实验研究
目的研究申克孢子丝菌野生株的致病性.方法制备申克孢子丝菌野生株的细胞悬液,注入小鼠体内,于接种后第1周开始至第10周,视发病情况每周分批处死、剖检,观察发病情况.结果从自然环境中分离的申克孢子丝菌通过不同注射途径进入小鼠体内后均可导致小鼠致病;其产生色素的黑色菌株与不产生色素的白色菌株致病性无差异(P>0.05);腹腔组与尾静脉组比较致病性有差异(P<0.05).结论申克孢子丝菌的野生株均具有致病性;黑白菌株致病性无显著差异;不同的致病途径致病性不同.
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“ITS/CAL"靶位分子鉴定结合表型分析确诊狭义申克孢子丝菌致淋巴管型孢子丝菌病一例
患者女,54岁,农民.左上肢近手腕部外伤后出现豌豆大小的单一红色结节15d,后肿大、破溃,并在30 d内发展为多个成串状分布的结节.皮肤科检查:患者左上肢可见多个呈线性排列的紫红色结节,质硬;部分结节破溃,伴少许脓性分泌物.组织病理提示,感染灶呈混合炎性细胞浸润为主的化脓性肉芽肿炎症;过碘酸雪夫染色阴性,未见真菌孢子、菌丝及星状体.活检组织真菌培养阳性.根据培养物形态学分析和内部转录间隔区(ITS)及钙调蛋白(CAL)编码区靶位的分子生物学鉴定结果,确诊该病例为狭义申克孢子丝菌致淋巴管型孢子丝菌病.给予患者10％碘化钾溶液10 ml/次每日3次口服;治疗2个月后,患者自觉症状明显改善,后失访.本例报道提示联合应用表型鉴定和“ITS/CAL”靶位的基因分析能够准确将孢子丝菌复合体鉴定到种水平.
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不同抗真菌药物对申克孢子丝菌的体外敏感性研究进展
近年来,条件致病性真菌感染的发病率及死亡率不断上升,申克孢子丝菌(SS)属于孢子丝菌属,为双相真菌,是孢子丝菌病的病原体,呈全球性分布,传播途径较多,极大危害人类的健康,日益受到人们的重视.但对于双相真菌的体外药敏试验至今没有统一标准.本文针对SS药敏试验方法和不同抗真菌药物对SS的体外敏感性研究进展做一综述.
