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亚硫酸氢盐测序法DNA甲基化标记筛查技术的改进研究
目的 改进DNA亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS),建立一种简便快速的甲基化标记筛查技术.方法 基因组DNA在亚硫酸氢盐处理、脱盐纯化后直接进入碱性的PCR体系,通过延长预变性时间完成修饰过程,然后进行常规亚硫酸氢盐PCR(bisulfite-PCR,BSP)扩增;首轮扩增产物再用5'端加有高GC标签序列的引物进行2次扩增,达到调整GC含量和直接测序的目的 .同时用传统和改进BGS法检测3T3-L1细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因和Hela细胞雄激素受体基因启动子的甲基化情况,以评估改进方案的可行性.并用Alu序列实时定量BSP技术比较传统和改进BGS法的灵敏度.结果 无论是高甲基化还是低甲基化片段,改进的BGS法均可实现BSP产物的直接测序,结果与传统法一致.改进法修饰的DNA转化率达到100%,特异度＞93.75%,灵敏度显著高于传统方法(t=2.978 2,P＜0.05),并有良好的重复性.结论 改进后的BGS方法简单灵敏,可用于甲基化标记的快速筛查.
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胃癌患者FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的甲基化研究
目的 探究人脆性组氨酸三联体(FHIT)基因、人mut1同源物(hMLH1)基因、p16基因、维甲酸受体(RAR)-beta(RAR-beta)基因、Reprimo基因和基质金属蛋白酶抑制因子3(TIMP3)基因在胃癌及相应的癌旁对照组织中甲基化状态.方法 采用亚硫酸氢钠测序法检测42例临床手术切除的胃癌标本及42例相应癌旁组织标本中FHIT基因、hMLH1基因、p16基因、RAR-beta基因、Reprimo基因和TIMP3基因甲基化水平.结果 胃癌组织及相应癌旁组织之间各基因的平均甲基化率分别为:FHIT基因(1.50％,1.36％)、hMLH1基因(4.77％,0.48％)、p16基因(9.63％,10.36％)、RAR-beta基因(4.75％,4.17％)、Reprimo基因(9.71％,3.76％)与TIMP3基因(18.34％,14.06％).癌旁对照组织与胃癌组织的Reprimo基因的平均甲基化率具有统计学差异(P<0.05).组织分化程度不同的胃癌患者Reprimo基因启动子甲基化率存在统计学差异(P<0.05).结论 胃癌中Reprimo基因启动子区胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛中存在甲基化现象.Reprimo基因的高甲基化率可以作为胃癌的潜在生物标记物,以便早期发现胃癌.
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FGR的胎盘组织印记基因PEG10DNA甲基化水平及其意义
目的 通过检测父方表达印记基因PEG10 DNA在胎儿生长受限(FGR)患者胎盘组织甲基化水平,探索FGR是否与其胎盘中印记基因的甲基化程度相关.方法 采用前瞻性研究,收集2014年1月至2017年1月在上海市第一人民医院宝山分院妇产科住院分娩的FGR者56例(研究组)和同期正常单胎晚孕分娩者56例(对照组),采用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测研究组和对照组胎盘组织的PEG10 DNA甲基化水平,分析其甲基化水平与FGR的临床病理关系.结果 FGR胎盘组织印记基因PEG10表现为异常甲基化水平,与对照组相比,研究组胎盘组织印记基因PEG10 DNA甲基化水平在CPG岛1无明显差异,而在CPG岛2及CPG岛3明显高于对照组(t值分别为94.97,7.16,均P<0.05),尤其以CPG岛2为明显(研究组表达为0.544±0.027,对照组表达为0.152±0.015).结论 胎盘组织父方表达的印记基因的DNA甲基化水平可能是导致FGR发病的原因之一.
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SOX11基因甲基化与宫颈癌的相关性研究
目的 检测正常宫颈组织、宫颈癌组织及宫颈癌细胞系中SOX11基因的甲基化状态并探讨甲基化状态与SOX 11基因表达的关系.方法 亚硫酸氢盐测序法及TA克隆分析正常宫颈、宫颈癌组织及宫颈癌细胞系中SOX 11基因启动子区DNA的甲基化状态.RT-PCR检测宫颈癌细胞系、宫颈癌组织及正常宫颈组织中SOX 11基因mRNA表达.结果 宫颈癌组织中SOX11基因呈高甲基化状态,平均甲基化率为81.07％,远高于正常宫颈组织中SOX11甲基化率(12.86％),差异具有统计学意义(P<0.001).宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、C33-A和CaSki中SOX11均呈高甲基化状态,其甲基化率分别为90.71％、97.14％、77.14％、99.64％.宫颈癌组织中SOX11基因mRNA的表达量远低于正常宫颈组织中的表达,差异有统计学意义(P<0.001).SOX11基因的表达与其启动子区高甲基化呈负相关(P<0.001,r=-0.808).经去甲基化剂5-氮杂胞苷处理后,在宫颈癌细胞系中SOX11 mRNA的表达水平明显升高.宫颈癌HPV感染可能增加SOX11启动子甲基化发生.结论 宫颈癌组织中SOX11基因启动子区的DNA高甲基化而使其表达沉默.
