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ROX参比荧光在实时荧光定量RT-PCR检测Nrf2mRNA中的应用
目的 建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法,评价ROX参比荧光在其分析中的归一化校正作用.方法 采用Taq Man探针法构建大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;取大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR产物,经凝胶电泳和测序鉴定反应特异性;取PCR标准品10个浓度梯度(2.0×109～2.0×100)各1份进行实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的标准曲线的线性范围的变化;取高、中、低值重组质粒样本各1份进行批内重复20次和批间连续20次实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的批内、批间重复性差异.结果 成功建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR扩增片段与预期122 bp相符,测序结果扩增片段序列正确,PCR特异性好;标准品PCR扩增结果的标准曲线线性范围未经ROX参比荧光校正为2.0×109～2.0×102拷贝/μl(R2＞0.99),校正后为2.0×109～2.0×100拷贝/μl(R2＞0.99),校正后线性范围变宽100倍.高、中、低值样本重复性分析结果显示未经ROX参比荧光校正批内Ct变异系数(CV)为4.1%、2.7%、2.1%,批间CV为4.3%、3.0%、2.4%,校正后批内CV为0.7%、0.5%、0.4%,批间CV为1.0%、0.8%、0.7%,ROX参比荧光校正后样本Ct离散程度均低于未校正组,批内、批间的高值、中值浓度样本(高值组批内和批间t值分别为4.843、2.566,中值组批内和批间t值分别为4.293、4.423,P均＜0.05),但低浓度组的Ct离散度的差异无统计学意义(低值组批内和批间t值分别为0.753、1.279,P均＞0.05).结论 在构建大鼠Nrf2实时荧光定量RT-PCR检测方法中,加入ROX参比荧光,可加宽PCR标准曲线的线性范围,提高检测重复性,为准确分析大鼠模型Nrf2 mRNA表达水平奠定了基础.
关键词： NF-E2相关因子2 逆转录聚合酶链反应 琥珀酰亚胺类 若丹明类 -
99Tcm-SHNH-AC133的制备及对荷结肠癌裸鼠的显像
目的 制名99Tcm-6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐(SHNH)-AC133,通过γ显像研究其靶向CD133阳性结肠癌的能力,探讨其作为肿瘤干细胞(CSCs)靶向分子探针的可行性.方法 采用免疫荧光法及流式细胞术检测人结肠癌Lovo细胞及肿瘤组织CD133的表达.以SHNH为双功能螯合剂,对CD133的特异性单克隆抗体AC133进行99Tcm标记,合成99Tcm-SHNH-AC133,检测其标记率及放化纯.建立荷结肠癌裸鼠模型,进行γ显像,利用感兴趣区技术获得肿瘤与对侧肌肉组织的肿瘤/正常组织放射性(T/NT)比值.注射标记物前,经荷瘤鼠尾静脉注射过量未标记的AC133进行阻断实验.采用两样本t检验分析数据.结果 免疫荧光检测结果显示,CD133表达于Lovo细胞表面.流式细胞检测结果显示,Lovo结肠癌组织中CD133阳性细胞的占比为(29.5±3.4)％.99Tcm-SHNH-AC133标记率＞85％,放化纯为(97.7±2.4)％.γ显像示,99Tcm-SHNH-AC133对Lovo肿瘤有较好的靶向性,12 h后瘤体逐渐显影,24h肿瘤部位放射性浓聚较明显,其T/NT比值为8.16±0.45.阻断实验中,肿瘤部位放射性摄取明显减少(3.52±0.13;t=19.8,P＜0.05).结论 99Tcm-SHNH-AC133具有较高的标记率及放化纯,该标记物对CD133阳性结肠癌具有较强的靶向能力,有望用于CSCs的体内示踪.
