首页 > 文献资料
-
可回复性永生化逆转录病毒载体pLNCTIGlox的构建与表达
目的:为建立可回复性永生化肝细胞株,构建带有筛选基因NeoR、报道基因EGFP及重组位点loxP的可回复性永生化逆转录病毒载体.方法:将2.1kb SV40T亚克隆到pIRES2-EGFP的相应位点,再酶切下3.4kb SV40T-IRES-EGFP片段插入逆转录病毒载体pLNCX2的两个相同酶切位点之间,构成新载体pLNCTIG.后,将线性化pLNCTIG和loxP双链片段混合连接.取连接产物转化高效感受态DH5α细胞.菌落PCR和酶切法鉴定阳性克隆.转染包装细胞PT67并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.扩大培养稳定转染的细胞,免疫组化染色检测SV40T基因的表达.结果:随机挑取19个克隆,3个电泳分离出约1.1kb阳性条带.取上述阳性克隆进行酶切鉴定,结果仅出现一条约9.5kb的条带,证明该克隆为阳性重组体.转染PT67细胞24 h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光.免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色.结论:成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pLNCTIGlox.
关键词： 可回复性永生化 肝细胞 pLNCTIGlox -
可回复性胰岛细胞永生化载体phTERT-I-GTKIox的构建与鉴定
目的 构建以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)为永生化基因、loxP为重组位点的可回复性永生化逆转录病毒载体.方法 采用EcoRI、Sal I双酶切、回收含有EGFP-胸苷激酶融合基因及LoxP序列的逆转录病毒载体pBTGTKlox,将经PCR扩增的IRES序列克隆入其中,构建成pI-GTKlox;将hTERT克隆入pI-GTKlox的EcoR I酶切位点,构建成phTERT-I-GTKlox.进行菌落PCR、酶切、测序鉴定.结果 菌落PCR鉴定5个菌落中2个为阳性克隆.阳性克隆质粒经Eco R I酶切鉴定形成预计的6.5 kb及3.5 kb两个片段,进一步经测序证实插入的hTERT序列无核苷酸突变.结论 成功构建了phTERT-I-GTKlox可回复性永生化逆转录病毒载体,为建立可回复性永生化胰岛细胞奠定了基础.
