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敲除PPK基因对幽门螺杆菌逃避巨噬细胞免疫清除的影响
目的:研究敲除多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK)基因后对幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylon)逃避巨噬细胞免疫清除的影响.方法:通过同源重组的原理构建H.pylori PPK敲除菌株.提取PPK敲除菌株体内多聚磷酸盐,转化为ATP进行定量,并与野生型菌株内多聚磷酸盐水平进行比较.将PPK敲除菌株及野生型菌株分别与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共同培养,比较存活的H.pylori数量.结果:成功构建敲除PPK的H.pylori菌种.Western blot显示该菌无PPK蛋白表达.对敲除PPK的H.pylori菌株中的多聚磷酸盐定量结果显示,其内PP含量为0.46±0.25 nmol Pi/mgProtein,显著低于G27野生菌种(175.33±21.22nmol Pi/mg Protein,P＜0.01).将该菌株与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共同培养,2h时间点,G27及G27APPK菌种在巨噬细胞内的存活无显著差异；而在24 h时间点,G27APPK菌种在巨噬细胞内的存活率显著低于野生型G27菌种,巨噬细胞内的BacLight kit染色结果显示,G27ΔAPPK菌种在巨噬细胞内获得染色的活菌显著低于野生型G27菌种.结论:PPK是H.pylori合成多聚磷酸盐的关键酶.敲除该基因后,H.pylori合成多聚磷酸盐的能力显著下降,其逃避巨噬细胞清除的能力明显减弱.
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幽门螺杆菌PPK的纯化与功能分析
目的:表达纯化幽门螺杆菌多聚磷酸激酶,并测定其功能.方法:将幽门螺杆菌多聚磷酸激酶基因克隆入原核表达载体PQE 80L中,在大肠杆菌(E.coli) DH5-α中表达.用BD Talon resin纯化目的蛋白.并在体外测定其合成多聚磷酸盐及转化多聚磷酸盐至ATP的能力.结果:成功构建了原核表达载体,得到高表达量的融合蛋白.经BD Talon resin纯化获得较高纯度的His-多聚磷酸激酶N端融合蛋白.体外实验证实该酶可以有效合成不同链长的多聚磷酸盐,并且在适当条件下可将多聚磷酸盐转化为ATP.结论:利用原核表达载体可很好表达幽门螺杆菌多聚磷酸激酶,纯化后的蛋白具有良好生物活性,是一个具备合成多聚磷酸盐及转化其为ATP的双向功能的酶.
