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胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin 体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5 d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10 μg/mLCTP-HBcAg18-27、10 μg/mL HBcAg18-27-Tapasin 及空白组RPMI 1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC；CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000); C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)]；流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000); C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.
关键词： 胞质转导肽 HBcAg18-27 Tapasin 树突细胞 T淋巴细胞 -
胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
目的 观察融合蛋白胞质转导肽(CTP) -HBcAg18-27 -Tapasin诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法 体外分离、培养近交系BALB/c小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-4培养5d,再加入脂多糖诱导成熟.10 μg/L CTP HBcAg18-27-Tapasin、50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin、10 μg/L CTP-HBcAg18-27及RPMI-1640培养液加入培养介质.流式细胞术测定DC表面分子表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞术检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.多个样本均数间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.结果 成功体外诱导小鼠髓源性DC; CTP-HBcAg18-27Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体Ⅰ分子的表达;50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL 12p70水平为(61.12±10.25)pg/mL,依次高于10μg/LCTP-HBcAg18-27 -Tapasin组的(50.43±10.42) pg/mL、10μg/L CTD HBcAg18-27组的(40.17±8.54) pg/mL和空白组的(30.51±8.03) pg/mL(F=15.85,P=0.030和P=0.037);CTP HBcAg18-27-Tapasin诱导DC刺激T淋巴细胞增值能力明显高于对照组;流式细胞仪检测融合蛋白诱导的CTL水平50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组为(2.05±0.41)％、10 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组为(1.06±0.10)％,高于10 μg/L CTP-HBcAg18-27组的(0.45±0.11)％和空白组的(0.09±0.02)％(F- 60.22,P=0.003).结论 CTP- HBcAg18-27-Tapasin可以促进DC的分化、成熟,增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力并能增加CTL的表达.
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CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白胞内转导功能的检测
目的:观察融合蛋白CTP-HBcAg18-27-Tapasin在抗原提呈细胞内的转导功能.方法:体外分离培养近交系BALB/c小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4培养5d,再加入脂多糖诱导DC成熟.不同剂量的CTP-HBcAg18-27-Tapasin及RP-MI-1640培养液加入细胞培养介质中,激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光在细胞内的分布及定位,并对荧光强度进行定量分析,进一步以Western blot观察不同组细胞中Tapasin表达的差异来检测CTP-HBcAg18-27-Tapasin的转导效率.结果:成功体外诱导培养并鉴定小鼠骨髓源性树突状细胞,免疫荧光法证实CTP-HBcAg18-27-Tapasin能够穿透树突状细胞膜进入细胞质,而不能进入细胞核,且荧光强度50 μg/L CTP-HB-cAg18-27-Tapasin组依次高于10 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组和空白组,Western blot 也证实CTP-HBcAg18-27-Tapasin能够穿透细胞膜进入树突状细胞,结果显示差异有统计学意义.结论:CTP-HBcAg18-27-Tapasin具有穿透树突状细胞膜定位于胞浆的能力.
关键词： CTP HBcAg18-27 Tapasin 转导 树突状细胞 -
CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达载体的构建及其表达和纯化
目的 构建CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合基因表达质粒并分离、纯化融合蛋白.方法 以质粒pCMV-SPORT6中Tapasin 基因为模板,设计一对引物,上游引物带有融合基因CTP-HBcAg18-27序列,进行PCR反应；PCR产物回收纯化克隆到质粒pREST-B 中,双酶切及测序鉴定；将鉴定正确的质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达；镍柱亲和层析法纯化融合蛋白；Western blotting 鉴定融合蛋白.结果 由质粒pCMV-SPORT6 PCR扩增得到1480 bp大小的条带,为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合序列；将其克隆到表达质粒pREST-B后经酶切、测序结果正确；表达质粒转化DE3后成功表达,经纯化得到52.3 KD的蛋白；Western blotting鉴定为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白.结论 成功构建了CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达质粒,并成功表达,为进一步研究此融合蛋白的功能提供了实验基础.
关键词： CTP Tapasin HBcAg18-27 融合蛋白 -
胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞抑制转基因小鼠HBV复制
目的 探讨经分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg18-27经CTP转导体内诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用. 方法 20只HBV转基因小鼠随机分组,100 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin,50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasi,50 μg CTP-HBcAg18-27及等渗盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次.流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平,微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中HBsAg水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBVDNA水平,肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.数据用均数±标准差((x-)±s)表示,用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法. 结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.70％±0.20％),其水平高于对照组50 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin (1.66％±0.53％)及50μg CTP-HBcAg18-27 (1.26％±0.56％)和空白组(0.75％±0.71％),F=741.45,P=0.000.肝脏HE染色及免疫组织化学结果显示实验组肝组织中炎性细胞的数量明显增多及HBsAg的表达显著减少,同时对小鼠血清中HBsAg及HBV DNA有明显的抑制作用. 结论 分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg 18-27经CTP转导免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量,显著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg的表达.
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乙型肝炎患者HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T细胞的研究
目的 对乙肝患者尤其是慢性乙肝患者外周血HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T细胞(CTL)的分布频率及功能状态进行研究.方法 应用多色流式分析结合HLA-A*0201限制性表位肽/五聚体复合物技术对乙肝患者外周血HBcAg18-27表位特异性CTL进行精确定量,应用胞内细胞因子染色技术结合流式细胞分析技术研究HBcAg18-27表位特异性CTL穿孔素,颗粒酶B,干扰素-γ的分泌水平.结果 在急性与慢性乙型肝炎患者外周血中均可测到HBcAg18-27表位特异性CTL,两者的分布频率存在显著性差异.慢性乙肝患者外周血中HBcAg18-27表位特异性CTL分泌穿孔素,颗粒酶B,干扰素的水平明显降低.结论 HBcAg18-27表位特异性CTL在乙型肝炎病毒清除中起到重要作用,慢性乙肝患者外周血HBcAg18-27表位特异性CTL存在功能缺陷.
关键词： 乙型肝炎 T淋巴细胞 细胞毒性 HBcAg18-27
