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胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin 体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5 d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10 μg/mLCTP-HBcAg18-27、10 μg/mL HBcAg18-27-Tapasin 及空白组RPMI 1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC；CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000); C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)]；流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000); C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.
关键词： 胞质转导肽 HBcAg18-27 Tapasin 树突细胞 T淋巴细胞 -
Tapasin对HLA-E细胞表面表达的影响
目的:探索伴侣分子Tapasin对HLA-E分子细胞表面表达的影响.方法:体外构建HLA-E cDNA的逆转录病毒表达载体,并通过感染的方法将其转入Tapasin阴性的T2细胞系,利用流式细胞术检测HLA-E分子在靶细胞表面的表达情况.结果:外源HLA-E基因在Tapasin阴性的T2细胞表面获得表达(74.13%) ,而对照细胞及经空载体转染的T2细胞表面未检测到HLA-E分子的表达.结论:HLA-E分子的细胞表面表达也存在TAP非依赖的方式.
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分子伴侣Tapasin在介导免疫反应中的作用
分子伴侣Tapasin是抗原提呈相关转运蛋白的基因产物,和MHC-Ⅰ同为免疫球蛋白超家族的成员,与MHC分子和多肽装配密切相关,是MHC-Ⅰ类分子与TAP之间的桥梁.Tapasin在抗原提呈过程中有着重要作用,因而了解其生物学特征、在介导免疫反应中的作用及与疾病的相关性具有重要意义.
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胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
目的 观察融合蛋白胞质转导肽(CTP) -HBcAg18-27 -Tapasin诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法 体外分离、培养近交系BALB/c小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-4培养5d,再加入脂多糖诱导成熟.10 μg/L CTP HBcAg18-27-Tapasin、50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin、10 μg/L CTP-HBcAg18-27及RPMI-1640培养液加入培养介质.流式细胞术测定DC表面分子表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞术检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.多个样本均数间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.结果 成功体外诱导小鼠髓源性DC; CTP-HBcAg18-27Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体Ⅰ分子的表达;50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL 12p70水平为(61.12±10.25)pg/mL,依次高于10μg/LCTP-HBcAg18-27 -Tapasin组的(50.43±10.42) pg/mL、10μg/L CTD HBcAg18-27组的(40.17±8.54) pg/mL和空白组的(30.51±8.03) pg/mL(F=15.85,P=0.030和P=0.037);CTP HBcAg18-27-Tapasin诱导DC刺激T淋巴细胞增值能力明显高于对照组;流式细胞仪检测融合蛋白诱导的CTL水平50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组为(2.05±0.41)％、10 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组为(1.06±0.10)％,高于10 μg/L CTP-HBcAg18-27组的(0.45±0.11)％和空白组的(0.09±0.02)％(F- 60.22,P=0.003).结论 CTP- HBcAg18-27-Tapasin可以促进DC的分化、成熟,增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力并能增加CTL的表达.
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Tapasin和HLA Ⅰ类分子在人卵巢癌中的表达及相关性
[目的]通过检测tapasin和HLA Ⅰ类分子在人卵巢癌中的表达,分析两者相关性,进而探讨卵巢癌的机体免疫逃逸机制.[方法]采用免疫组化SP法检测了53例卵巢癌、40例卵巢良性上皮瘤、30例正常卵巢组织中的tapasin和HLA Ⅰ类分子的表达.[结果](1)卵巢癌中HLA Ⅰ类分子的表达显著低于良性上皮瘤及正常卵巢组织(P<0.001),且卵巢癌中的HLA Ⅰ类分子的表达水平与FIGO分期有关(P<0.05).(2)tapasin在卵巢癌中呈现低表达,且其表达水平与卵巢癌中HLA Ⅰ类分子异常表达呈正相关(r=0.507,P<0.001).[结论](1)人卵巢癌细胞低表达HLA Ⅰ类分子可能是卵巢癌机体免疫逃逸机制之一.(2)人卵巢癌低表达HLAⅠ分子可能与tapasin低表达有关.
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CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白胞内转导功能的检测
目的:观察融合蛋白CTP-HBcAg18-27-Tapasin在抗原提呈细胞内的转导功能.方法:体外分离培养近交系BALB/c小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4培养5d,再加入脂多糖诱导DC成熟.不同剂量的CTP-HBcAg18-27-Tapasin及RP-MI-1640培养液加入细胞培养介质中,激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光在细胞内的分布及定位,并对荧光强度进行定量分析,进一步以Western blot观察不同组细胞中Tapasin表达的差异来检测CTP-HBcAg18-27-Tapasin的转导效率.结果:成功体外诱导培养并鉴定小鼠骨髓源性树突状细胞,免疫荧光法证实CTP-HBcAg18-27-Tapasin能够穿透树突状细胞膜进入细胞质,而不能进入细胞核,且荧光强度50 μg/L CTP-HB-cAg18-27-Tapasin组依次高于10 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组和空白组,Western blot 也证实CTP-HBcAg18-27-Tapasin能够穿透细胞膜进入树突状细胞,结果显示差异有统计学意义.结论:CTP-HBcAg18-27-Tapasin具有穿透树突状细胞膜定位于胞浆的能力.
关键词： CTP HBcAg18-27 Tapasin 转导 树突状细胞 -
分子伴侣Tapasin在介导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应中的作用
病毒及肿瘤细胞的清除很大程度上依赖于特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL),CTL通过T细胞受体(TCR)特异性识别病毒肽段并通过MHC-Ⅰ类分子提呈引起感染细胞融解,经典MHC-Ⅰ类分子在内质网内的装配要求有抗原肽配体和β2微球蛋白(β2m)的存在,而这一过程需要伴侣分子(chaperones)如Tapasin的参与.Tapasin是抗原递呈相关转运体(TAP)相关蛋白的基因产物,与MHC-Ⅰ类分子同为免疫球蛋白超家族成员,在介导特异性CTL反应中有着重要作用,本文简述了Tapasin分子结构特征、在介导特异性CTL反应中的作用及与疾病的联系.
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CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达载体的构建及其表达和纯化
目的 构建CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合基因表达质粒并分离、纯化融合蛋白.方法 以质粒pCMV-SPORT6中Tapasin 基因为模板,设计一对引物,上游引物带有融合基因CTP-HBcAg18-27序列,进行PCR反应；PCR产物回收纯化克隆到质粒pREST-B 中,双酶切及测序鉴定；将鉴定正确的质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达；镍柱亲和层析法纯化融合蛋白；Western blotting 鉴定融合蛋白.结果 由质粒pCMV-SPORT6 PCR扩增得到1480 bp大小的条带,为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合序列；将其克隆到表达质粒pREST-B后经酶切、测序结果正确；表达质粒转化DE3后成功表达,经纯化得到52.3 KD的蛋白；Western blotting鉴定为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白.结论 成功构建了CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达质粒,并成功表达,为进一步研究此融合蛋白的功能提供了实验基础.
关键词： CTP Tapasin HBcAg18-27 融合蛋白 -
胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞抑制转基因小鼠HBV复制
目的 探讨经分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg18-27经CTP转导体内诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用. 方法 20只HBV转基因小鼠随机分组,100 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin,50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasi,50 μg CTP-HBcAg18-27及等渗盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次.流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平,微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中HBsAg水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBVDNA水平,肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.数据用均数±标准差((x-)±s)表示,用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法. 结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.70％±0.20％),其水平高于对照组50 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin (1.66％±0.53％)及50μg CTP-HBcAg18-27 (1.26％±0.56％)和空白组(0.75％±0.71％),F=741.45,P=0.000.肝脏HE染色及免疫组织化学结果显示实验组肝组织中炎性细胞的数量明显增多及HBsAg的表达显著减少,同时对小鼠血清中HBsAg及HBV DNA有明显的抑制作用. 结论 分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg 18-27经CTP转导免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量,显著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg的表达.
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胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及HBV特异性CTL的表达
目的 观察融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的表达.方法 C57BL/6小鼠随机分为实验组CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组CTPHBcAg18-27、HBcAg18-27-Tapasin及空白组(生理盐水).经肌肉免疫小鼠,ELISA检测T淋巴细胞分泌细胞因子；流式细胞术(FCM)检测T淋巴细胞内的细胞因子；CCK-8法检测T淋巴细胞增殖活性.结果 实验组能有效刺激小鼠T细胞分泌Th1型细胞因子；FCM检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平明显高于其他组；且实验组T淋巴细胞增殖活性明显高于对照组及空白组.结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫C57BL/6小鼠后,能提高T淋巴细胞增殖活性,能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTLs的表达.
