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一种新的基因灭活工具——甲基化寡核苷酸技术
后基因组时代的分子生物学研究重点转向了基因功能的研究.基因功能研究中涉及到对过度表达的基因进行抑制或者灭活.本文简要回顾和评价了基因敲除、反义寡核苷酸技术和RNA干扰技术等常用的基因灭活工具,着重对有可能成为第四代基因灭活工具的甲基化寡核苷酸技术,从产生背景、作用机制、技术路线、应用现状及前景等方面进行了详细的论述,以期引起注意和重视.
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甲基化寡核苷酸灭活DKK3基因对肝癌细胞增殖的影响
目的 研究甲基化寡核苷酸灭活Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3,DKK3)基因对HepG2肝癌细胞增殖的影响. 方法 采用甲基化特异性PCR法检测肝癌细胞DKK3基因启动子甲基化状态.将寡核苷酸(分别为MON组、UMON组、CON1组和CON2组)转染HepG2肝癌细胞,比较转染后DKK3基因启动子甲基化状态、细胞增殖和凋亡的差异. 结果 HepG2肝癌细胞DKK3基因启动子未检测到甲基化,Hep3B、SMMC-7721和HuH-7肝癌细胞DKK3基因启动子处于甲基化状态.MON可成功诱导其互补序列CG位点产生甲基化,而UMON、CON1和CON2寡核苷酸无法诱导甲基化.UMON组、CON1组和CON2组HepG2肝癌细胞在D0-D6吸光度、G0/G1期、S期、GJM期、增殖指数(prolif-eration index,PI)和凋亡率方面差异均无统计学意义(均P＞0.05);MON组HepG2肝癌细胞G0/G1期比例和凋亡率均显著低于UMON组、CON1组和CON2组(均P＜0.05),而D1-D6吸光度、S期、G2/M期和PI均显著高于UMON组、CON1组和CON2组. 结论 甲基化寡核苷酸可成功诱导DKK3基因甲基化,导致HepG2肝癌细胞细胞增殖增加而凋亡下降.
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甲基化寡核苷酸灭活死亡相关蛋白激酶1基因对白血病K562细胞增殖的影响
目的 探讨互补甲基化寡核苷酸诱导灭活K562白血病细胞死亡相关蛋白激酶1基因(DAPK1)及对其增殖的影响.方法 应用Lipo2000将与DAPK1基因启动子序列互补的甲基化寡核苷酸转染进K562白血病细胞,分别应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和反转录PCR(RT-PCR)检测转染前后DAPK1基因启动子甲基化状态和mRNA表达改变.应用噻唑蓝(MTT)法检测转染前后细胞增殖变化.结果 正常组K562细胞的DAPK1基因启动子表现为未甲基化状态,可检测到相应mRNA表达;对照组寡核苷酸转染后,DAPK1基因启动子表现为未甲基化状态,mRNA表达和细胞增殖速度与正常组无明显差异;互补甲基化寡核苷酸转染后,DAPK1基因启动子呈甲基化状态,mRNA呈低表达状态,细胞增殖速度较正常组、甲基化对照寡核苷酸转染组显著增加.结论 互补甲基化寡核苷酸可诱导灭活K562白血病细胞DAPK1基因并抑制其mRNA表达,促进细胞增殖.
