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SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响
目的:探讨SB431542对肝星状细胞T6(HSCT6)Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响.方法:HSC T6细胞贴壁后,在细胞培养瓶中加入SB431542 10 μmol/L培养2h,用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察细胞内Smad4蛋白细胞内转位.将HSC T6细胞分成3组:空白对照组、SB431542 1 μmol/L组、SB431542 10 μmol/L组,培养24 h后分别提取细胞浆蛋白及核蛋白,以Western blot法检测Smad4蛋白表达水平变化.结果:SB431542 10 mol/L作用2h后,未出现Smad4蛋白向细胞核内转位.HSC T6细胞贴壁后被SB431542 1 μmol/L、SB431542 10 μmol/L作用24 h后,细胞浆内Smad4蛋白表达量较空白对照组减少,呈剂量依赖型；而细胞核内Srnad4蛋白表达量较空白对照组增多.结论:SB431542通过抑制大鼠HSC活化过程中Smad4蛋白在细胞内的核转位,可起到阻断TGF-β1/Smad通路的细胞内信号转导的作用.
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SB431542对人牙龈间充质干细胞体外成骨分化的影响
目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)信号通路抑制剂SB431542在体外对人牙龈间充质干细胞(hGMSCs)增殖及成骨分化能力的影响.方法:组织块法原代培养hGMSCs,采用流式细胞术检测表面标志物,然后给予不同浓度(0、0.1、1、10μmol/L)SB435142处理,CCK-8及流式细胞仪分别检测增殖活性及凋亡比例;成骨培养基分组诱导培养21 d后,进行茜素红染色,检测成骨分化;hGMSCs给予1μmol/L SB431542处理,采用Western blot检测成骨诱导过程中的成骨相关蛋白的表达及TGF-β 信号通路信号分子的变化.结果:原代培养的hGMSCs高表达CD105、CD90和CD73,而阴性表达CD14、CD34、CD19、CD45和人类白细胞DR抗原(HLA-DR).与对照组相比,各处理浓度SB431542并不引起hGMSCs凋亡率的明显改变(P>0.05).而10μmol/L SB431542作用于hGMSCs第7天时,细胞增殖能力较对照组降低(P<0.05).1μmol/L SB431542能显著增加hGMSCs矿化结节的形成(P<0.05),且在成骨诱导11 d后,Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于对照组及空白组(P<0.05).成骨诱导30、60 min时,SB431542处理组的TGF-β 信号通路下游Smad3信号分子磷酸化水平明显被抑制(P<0.05).结论:SB431542可能通过抑制成骨分化过程中Smad3的磷酸化水平来诱导hGMSCs体外成骨.
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SB431542和TGF-β1对甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞α-SMA及CTGF基因表达的影响
目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和SB431542(TGF-β1受体酶抑制剂)对甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)患者眼眶成纤维细胞α平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因表达的影响,为TAO眼外肌纤维化的治疗寻找潜在的药物治疗靶点.方法 实验分为3组.第1组:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time PCR,RT-PCR)检测不同浓度TGF-β1(0μg·L-1、1 μg·L-1、5μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1)刺激TAO患者眼眶成纤维细胞后α-SMA及CT-GF mRNA的表达情况;第2组:采用RT-PCR检测10 μg· L-1 TGF-β1在不同的时间点(Oh、3h、6h、12 h、24 h、48 h)刺激TAO患者眼眶成纤维细胞后oα-SMA及CTGF mRNA的表达情况;第3组(分为4小组处理):眼眶成纤维细胞不加任何干预、使用30 μmol·L-1 SB431542刺激眼眶成纤维细胞、10 μg·L-1 TGF-β1单独刺激眼眶成纤维细胞、30 μmol·L-1 SB431542联合10 μg·L-TGF-β1刺激眼眶成纤维细胞(SB431542预先刺激眼眶成纤维细胞1h,然后再加入TGF-β1),采用RT-PCR检测α-SMA及CTGF mRNA的表达.结果 TGF-β1在一定的浓度范围内(1～10 μg·L-1)以剂量依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA及CTGFmRNA,随着浓度增加mRNA表达增加,各浓度组(1μg·L-1、5 μg· L-1、10 μg·L-1、20 μμg·L-1)与空白对照组(0μg·L-1)相比,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).TGF-β1在一定的时间范围内(0～24 h)以时间依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA及CTGF mRNA,随着时间延长mRNA表达增加,各时间组(3h、6h、12 h、24 h、48 h)与Oh相比,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).10 μg·L-1的TGF-β1诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA在24 h达到峰值,而CTGF mRNA在12h即可达到峰值.SB431542对眼眶成纤维细胞α-SMA mRNA及CTGF mRNA的表达均有抑制作用.结论 一定范围内,TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞α-SMA及CTGF mRNA的表达,SB431542可抑制其表达.
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转化生长因子-β1对α粒子诱发人支气管肺癌细胞miR-200表达影响
目的 探讨转化生长因子(TGF)-β1及其特异性抑制剂SB431542分别作用于α粒子诱发人支气管上皮细胞系(BEP2D)恶性转化的支气管肺癌细胞RHT35细胞后,miR-200a、-200b、-200c表达的变化.方法 用实时荧光定量聚合酶链反应检测TGF-β1作用RHT35细胞后miR-200a、-200b、-200c表达的时程变化;同时分析SB431542作用RHT35细胞48h后,miR-200a、-200b、-200c的表达变化.结果 与对照组比较,TGF-f1作用之后,miR-200家族总体下调.对于miR-200a,除72 h外,其余时间点表达上调(P＜0.001);miR-200b在TGF-β1作用之后,144 h下降地明显(P＜0.05);miR-200c在TGF-β1作用之后,除72 h之外,其余各点均显著下调(P ＜0.001).SB431542作用RHT35细胞48h后,miR-200a、-200b、-200c分别是对照组的1.68(P ＜0.05)、1.86(P ＜0.001)和1.46倍(P＜0.05).结论 TGF-β1及其抑制剂能使RHT35细胞中miR-200家族表达发生变化.
