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HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达
目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达.方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlappingextension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞.结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,证明连接正确;经间接免疫荧光检测正实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白.结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性生免疫治疗提供了实验依据.
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胰腺癌细胞株Pc-3、HS766T DPC4基因的表达检测及其对细胞增殖的影响初探
目的:了解Pc-3、HS766T两个胰腺癌细胞株DPC4基因的表达情况.方法:用Trizol试剂提取两个细胞株培养细胞的总RNA,用RT-PCR的方法合成DPC4的cDNA并经与标准cDNA电泳确认后,用Qiagen PCR纯外试剂盒纯化,将纯化的cDNA与克隆载体Pt-Adv连接,并用连接产物转化大肠杆菌,扩增后提取质粒,经酶切鉴定后,送上海博亚公司测序,并上网与基因库中DPC4的cDNA比较,同时观察两个细胞株肿瘤细胞的生长情况.结果:HS766T细胞无DPC4基因表达(同源缺失),Pc-3细胞存在DPC4基因表达,但其cDNA片段与理论值相比,短约200bp,上网BLAST的结果表明,在中间连接区,有一236bp的片段缺失.两个细胞生长观察表明,Pc-3细胞生长明显慢于HS766T.结论:胰腺癌细胞株HS766T中DPC4基因同源缺失,细胞具有生长快速的特点.胰腺癌细胞株Pc-3中有正常功能的DPC4表达,但该DPC4转录产物显示,在其连接区有一236bp的片段缺失.该片段缺失对DPC4功能的具体影响尚不明确.
