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MEF2A第11号外显子四个特殊变异位点的生物学活性研究
目的 建立MEF2A蛋白细胞学定位和转录激活活性的体外检测体系,探讨MEF2A第11号外显子四个特殊变异位点的生物学意义.方法 构建含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因真核表达载体的MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A和变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-Mut;通过脂质体介导的方法 将以上质粒转染到Hela和293T细胞,用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的定位表达情况.构建含HRC基因启动子/增强子序列的萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-HRC enhancer,将该质粒与野生型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA,或变异型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA-Mut,以及海肾荧光素酶质粒pRL-TK,用脂质体转染法共转染于293T细胞,Western blot检测MEF2A蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶报告基因的表达.结果本研究建立的细胞学定位和转录激活活性检测体系均可有效检测MEF2A蛋白的生物学活性;与野生型MEF2A蛋白相比,四种MEF2A特殊变异蛋白的细胞学定位和转录激活活性均无显著性差异.结论 本研究发现的MEF2A基因第11号外显子四个含特殊变异位点的MEF2A变异蛋白不会影响其细胞学定位和转录激活的生物学活性.
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MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其转录激活活性的相关性
目的 探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其转录激活活性的相关性.方法 PCR法扩增富含组氨酸钙结合蛋白(histidine-rich calcium-binding protein,HRC)基因启动子/增强子序列,插入报告载体pGL3-Basic中,生成pGL3-HRC enhancer质粒,该质粒与全长野生型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA,或含4～15个CAG的变异型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA-CAGr,以及内参质粒pRL-TK,用脂质体转染法共转染于293T细胞,Westernblot检测MEF2A蛋白的表达,双荧光素酶检测系统测定报告分子的表达.结果 成功构建了MEF2A蛋白体外转录激活活性检测系统;所构建的含4～15个CAG序列的MEF2A变异蛋白,与含11个CAG序列的野生型MEF2A蛋白之间其转录激活活性没有显著性差异.结论 目前已发现的MEF2A第11号外显子CAG重复数目的 改变不会影响MEF2A蛋白的转录激活活性.
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IRF4与MITF协同作用于络氨酸酶启动子的相关机制
目的:探索干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4,IRF4)与小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)协同作用激活络氨酸酶(tyrosinase,TYR)启动子的作用机制.方法:利用荧光素酶检测、细胞免疫荧光蛋白定位、GST融合蛋白沉降技术(GST-pull down)、免疫共沉淀等多种体外细胞实验学方法,观察IRF4与MITF的协同转录激活效应、亚细胞定位和蛋白-蛋白相互作用情况.结果:IRF4与MITF蛋白共同表达于细胞核;IRF4可以增强MITF在TYR启动子上的转录激活作用,产生协同效应,而在其他MITF目标启动子上不产生;IRF4不能单独激活TYR启动子,且与丧失功能的MITF突变蛋白在TⅥ启动子上不能产生协同作用;两个蛋白之间无直接相互作用.结论:IRF4与MITF在TYR启动子上产生协同作用,该效应主要依靠MITF进行调节;两个蛋白之间的相互作用可能需要DNA参与.
关键词： 干扰素调节因子4 小眼畸形相关转录因子 络氨酸酶 转录激活作用 协同作用
