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腺苷在"缺血"条件下对绵羊浦肯野纤维起搏离子流If的影响
目的:观察腺苷在正常和"缺血"条件下对浦肯野纤维起搏离子流If的影响.方法:成年绵羊离体心室浦肯野纤维分腺苷组、"缺血"+腺苷组及"缺血"+腺苷+异丙肾上腺素组(n均=10),用双微电极电压钳制术,分别观察不同膜电位水平的起搏离子流If幅值和激活时间.结果:腺苷组起搏离子流If幅值降低(P＜0.05);"缺血"+腺苷组起搏离子流If幅值在"缺血"时不仅降低(P＜0.05),且激活时间延长;加腺苷后起搏离子流If幅值进一步降低(与"缺血"对照P＜0.05);而"缺血"+腺苷+异丙肾上腺素组起搏离子流If幅值低于正常对照(P＜0.05).结论:腺苷对浦肯野纤维自律活动在正常和"缺血"液中都有抑制作用,大量儿茶酚胺只能部分逆转"缺血"抑制效应.
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If离子流和心脏起搏
If离子流(funny current.If,奇特离子流)是80年代初DiFrancesco研究小牛心脏浦肯野纤维起搏原理时发现并命名的1,2.由于已知的电压依赖性离子通道都在心肌细胞膜电位除极时激活开放,唯独If通道在膜过度极化时激活开放.故名事实上,在DiFrancesco之前,Noma和Irisawa已经在研究窦房结起搏活动时,发现这一离子流,他们命名之为Ih(hyperplarization activated catloll current,过度极化激活正离子流)[3].由于嗣后20年中,DiFmncesco实验室专致于If研究.且有不少新发现,故起搏离子流If这名词已放广泛接受.
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LPC对缺血心肌起搏离子流的影响及ISO的效应
目的:观察在缺血条件下,溶血磷脂酰胆碱(LPC)对心肌起搏离子流(If)的影响以及能否被异丙肾上腺素(ISO)逆转.方法:采用双微电极电压钳制术,在各钳制电位测定并比较缺血心肌加入LPC和LPC加ISO的起搏离子流(If)幅值.结果:缺血降低If幅值,在模拟缺血液中加入LPC 2×10-5mol/L,If幅值在Ec -80～-120 mV水平进一步显著降低(n=5,P<0.05),加重了缺血对If离子流的抑制作用.在模拟缺血液中同时加入LPC 2×10-5mol/L和ISO 1×10-6mol/L,If幅值在Ec -90～-120 mV水平比模拟缺血时有显著增加(n=8,P<0.05),但未能达到缺血前基础水平.结论: 急性心肌缺血时,毒性代谢产物 LPC 加重起搏离子流的受抑程度,即使局部儿茶酚胺大量释放和积聚,也不能完全逆转上述抑制效应.
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铬对绵羊浦肯野纤维起搏离子流(If)的影响
目的探索Cr3+对自律细胞起搏离子流If的影响.方法双微电极电压钳制术,观测Cr3+对起搏离子流If,在膜电位-70～120 mV各指令电位的If幅值和激活时间的改变.结果Cr3+对起搏离子流If有明显的抑制作用,If幅值降低(n=7,P＜0.05～0.01),激活曲线向超极化方向移位,激活时间无变化.结论Cr3+对起搏离子流If有抑制作用,从而使正常的自律活动有所减弱,即可能具有一定的抗心律失常作用.
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腺苷和异丙肾上腺素对缺血浦肯野纤维起搏离子流的影响
目的探讨缺血条件下不同浓度腺苷(Ad)和异丙肾上腺素(Iso)对绵羊浦肯野纤维起搏离子流(If)的影响.方法成年绵羊离体心室浦肯野纤维分为对照组、不同浓度腺苷组、缺血组、缺血+不同浓度腺苷组和缺血+不同浓度腺苷+ Iso(1 μmol/L)组,用双微电极电压钳制术,分别观察在膜电位-70 ～ -120 mV各指令电位的If 幅值和激活时间. 结果不同浓度腺苷组If 幅值降低,呈一定的剂量依赖性,激活曲线向超极化方向移位,但激活时间无明显改变.缺血组If幅值降低,激活曲线向超极化方向移位,激活时间延长;缺血+不同浓度腺苷组If 幅值进一步降低, 腺苷的剂量有不同程度加剧缺血对If 离子流的抑制作用;而缺血+不同浓度腺苷+Iso组If 幅值与缺血组相比无显著性变化,但与对照组相比If 幅值降低,且与腺苷剂量成正比.结论腺苷对正常自律活动有一定的剂量依赖性抑制作用, 它能使缺血时已受抑的自律活动进一步受抑;局部即使存在大量Iso,只能部分改善缺血+腺苷的抑制效应,但不会使自律活动过度增强.
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不同浓度腺苷对正常及"缺血"绵羊浦肯野纤维If离子流的影响
目的研究不同浓度腺苷(Ado)对正常、"缺血"浦肯野纤维起搏离子流If的影响.方法成年绵羊离体心室浦肯野纤维分为对照组、10-6～10-4mol/L Ado组、缺血加10-6～10-4mol/L Ado组.用双微电极电压钳制术,分别观察在膜电位-70～-120mV各指令电位的If幅值和激活时间.结果10-6～10-4mol/L Ado组If幅值降低,激活曲线向超极化方向移位,呈一定的剂量依赖性,但激活时间无明显改变."缺血"液灌流后If幅值降低(n=10,P＜0.05～0.01),激活曲线向超极化方向移位,激活时间延长;缺血加10-6～10-4mol/L Ado组则If幅值进一步减少(n=10,P＜0.05～0.01),加剧了"缺血"对If离子流的抑制作用(n=10,P＜0.05),也呈一定的剂量依赖性.结论10-6～10-4mol/L Ado对正常自律活动有抑制作用,呈一定的剂量依赖性,"缺血"时,10-6～10-4mol/L Ado能使已受抑的自律活动进一步受抑,也呈一定的剂量依赖性.
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出生后心率变慢的窦房结调控机制
用离体兔心灌流、窦房结细胞动作电位记录、膜片钳实验和放射免疫分析细胞内cAMP含量等方法, 研究不同周龄组兔心自律性变慢的心脏内源性因素.实验结果提示, 离体心脏和窦房结标本在没有神经体液因素影响的情况下也有随周龄增长而自律性变慢的现象.进一步的实验提示, 这可能是由于窦房结细胞内cAMP含量下降, 使起搏离子流If的阈电位向负方向移位, 造成窦房结细胞4期自动除极速率降低, 后导致心率变慢.上述结果表明, 成长过程中的心率变慢, 除有神经体液因素影响外, 窦房结细胞本身自律性的改变也起了一定作用.
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Cs对兔窦房结细胞起搏离子流If和IK及自律活动的影响
运用微电极记录窦房结细胞动作电位及穿孔膜片箝技术(perforated patch)记录酶解游离的窦房结细胞电流,研究兔心窦房结的起搏原理.实验结果显示,Cs对自律性动作电位的频率及4期自动除极速率仅有轻度抑制作用.在同一细胞、同一时间、同一测试电位范围内,Cs能基本阻断If及它的电导变化而对Ik电流无明显抑制作用.上述结果表明在兔心窦房结细胞的起搏活动初期,If不是起搏的主要因素.
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溶血磷脂酰胆碱对缺血条件下羊浦肯野纤维If电流的影响
本文用双微电极电压箝制术观察"缺血"及毒性代谢产物溶血磷脂酰胆碱(LPC)对绵羊心室浦肯野纤维起搏离子流If的影响.用模拟缺血溶液灌流15,30和60min后,在-60mV～-120mV之间的各不同指令电位水平If离子流幅值均降低(n=5,P＜0.05),激活达稳态时间及半激活时间延长(n=5,P＜0.05),稳态激活曲线向超极化方向移位.在正常台氏液中加入2×10-5mol/L LPC,灌流后,各个膜电位水平的浦氏纤维起搏离子流If的幅值显著降低(n=10,P＜0.05),稳态激活曲线向超极化方向移位,但If激活达稳态时间及半激活时间均无明显改变.在模拟缺血溶液灌流30 min基础上,再加2×10-5mol/L LPC灌流,15 min后测得If幅值进一步减小(n=10,P＜0.05),加剧了"缺血"对If离子流的抑制作用.上述结果表明:缺血代谢产物溶血磷脂酰胆碱对心室的正常自律活动具有抑制作用,在模拟缺血条件下,它能使已受抑制的自律活动抑制进一步加深.因此它的存在不会异常增强心室自律性活动而发生快速性室性心律失常.
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mHCN4基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞重建起搏离子流通道
目的 观察超极化激活的环核苷酸门控通道亚型4(mHCN4)外源基因对小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)的转染及其功能表达.方法 2个月大昆明小鼠拉颈处死,无菌条件下分离股、胫骨,收集骨髓细胞种植于塑料培养瓶,24 h后更换培养液,保留贴壁细胞,待细胞达90%融合时胰酶消化传代培养.收集第3代贴壁细胞,用免疫磁珠法分选CD11b-细胞继续扩增培养.以pUC18、pcDNA3-mHCN4、pIRES2-EGFP、pMSCV-puro等质粒载体为架构,用不同酶类将目的片段连接构建pMSCV-mHCN4-EGFP及pMSCV-EGFP逆转录病毒载体.载体转染PT67包装细胞,收集逆转录病毒上清转染第3代扩增的mMSCs细胞,观察mMSCs的转染效果及阳性转染细胞的mHCN4通道动力学特性.结果 mMSCs的转染效率约10%～20%.mHCN4基因转染组可记录到明显的时间依赖性的超极化激活内向电流(If),If的半数大激活电压为-99.0±5.8 mV,在-140 mV电压时的激活时间常数为451±61ms.该电流对CsCl高度敏感;对照组细胞在超激化状态下无明显的电流出现.结论 mHCN4外源基因可在mMSCs中成功表达起搏离子流通道,基因修饰后的mMSCs有可能成为一种有效的生物起搏种子细胞.
关键词： 电生理学 间充质干细胞 超极化激活的环核苷酸门控通道 小鼠 起搏离子流 -
模拟缺血-再灌注对窦房结细胞起搏离子流的影响及KATP通道开放剂的干预作用
探讨模拟缺血-再灌注对窦房结细胞起搏离子流(If)的影响及KATP通道开放剂Pinacidil的干预效果.分离乳鼠窦房结细胞,纯化培养2天后进行实验.随机分为对照组、模拟缺血-再灌注组(I/R)、KATP通道开放剂Pinacidil干预组(P+I/R)及KATP通道阻断剂5-HD干预组(5-HD+P+I/R及5-HD+I/R).采用常规全细胞膜片钳技术及多导管灌流系统,测定各组细胞If密度,并绘制If激活曲线.结果:①每个窦房结细胞均可记录到If电流,在相同指令电压下,I/R组窦房结细胞If密度值较对照组明显增加(P<0.01);而P+I/R组则较I/R组显著减小(P<0.01);5-HD+P+I/R及5-HD+I/R两组又较P+I/R组明显增加(P<0.01),但与I/R组比较无显著差异.②与对照组比较,I/R组窦房结细胞的If激活曲线发生右移,半数大激活电压由-108.0±12.4 mV变为-89.5±7.2 mV(P< 0.01);P+I/R组窦房结细胞If激活曲线较I/R组左移,半数大激活电压为-99.5±10.8 mV(P<0.05);KATP通道阻断剂5-HD可阻断Pinacidil对If激活曲线的影响.结论:KATP通道开放剂Pinacidil可对抗模拟缺血-再灌注对窦房结细胞If的影响,此有利于维持模拟缺血-再灌注时窦房结细胞离子稳态和电生理活动的相对稳定.
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Shox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化
目的 探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,cMSCs)体外诱导分化的影响.方法 分离培养犬骨髓间充质干细胞,用包装好的两种慢病毒载体pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP分别转染第3代cMSCs,收集转染阳性的cMSCs与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养.实验分4组:A组(RFP-cMSCs组)、B组(RFP-cMSCs+ NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-cMSCs组)、D组(Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs共培养组).共培养诱导分化5d后,利用嘌呤霉素对cMSCs进行纯化,运用全细胞膜片钳检测诱导出内向电流的动力学特征,运用实时荧光定量PCR、Western blot检测HCN4、Tbx3、Cx45/43、Nkx2.5等标志性基因mRNA和蛋白的表达情况,并行免疫荧光检测.结果 Western blot及RT-PCR检测结果显示,D组细胞Shox2、HCN4、Tbx3、Cx45窦房结细胞特异性基因的表达较A、B、C组明显增高(P＜0.05),B组细胞Cx43及Nkx2.5较C、D组细胞明显增高(P＜0.05);免疫荧光结果显示,在Shox2基因调控作用下,cMSCs有HCN4通道生成;膜片钳检测结果显示,C、D组细胞产生了具有明显时间-电压依赖性的内向电流,且对细胞外Cs+敏感,符合起搏离子流Ⅰf的动力学特征;而A、B组未检测出此电流.结论 经mShox2基因修饰的cMSCs通过体外诱导,产生了起搏离子流Ⅰf并高表达窦房结标志性基因,成功向具有一定自主搏动能力的窦房结样细胞分化.
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模拟缺血预适应对原代培养乳鼠窦房结细胞起搏离子流的影响
目的通过比较模拟缺血预适应(IP)及模拟/再灌注(I/R)对原代培养乳鼠窦房结细胞起搏离子流(If)的影响,探讨IP对I/R时乳鼠窦房结细胞电生理活动的保护作用.方法取培养2 d的乳鼠窦房结细胞,随机分为:①对照组;②模拟I/R组;③模拟IP组.以全细胞膜片钳技术检测窦房结细胞If的变化.结果①模拟I/R组各指令电压下的If密度较对照组显著增高,激活曲线右移,半数大激活电压由(-98.9±2.4) mV变为(-85.2±2.5) mV (P<0.01 ).②模拟IP能显著降低I/R后的If密度,使激活曲线左移,半数大激活电压变为(-93.3±2.8)mV (P<0.01 ),但未恢复到对照水平(P<0.05 ).结论模拟IP可抑制模拟I/R后活化增强的If,有助于维护I/R时窦房结细胞电生理活动的相对稳定性.
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关于心肌起搏离子流的研究
起搏电流If是在心肌膜电位4期记录到的随时间而增强的内向电流,它在自律细胞的自动节律性兴奋中有着重要的意义,因而在心肌电生理学研究中受到关注.本文主要对它在心肌浦肯野纤维和窦房结细胞中的作用与机制的研究情况作一简介.
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兔窦房结细胞三种主要起搏离子流的作用
目的应用不同的起搏离子流通道阻断剂,观察If、IK和ICa.T在自律性活动中的作用,以比较它们作用的大小.方法细胞内微电极技术记录兔心窦房结细胞自律性动作电位,研究它们对自律性活动的影响.结果用E4031(1 μmol/L)阻断钾通道,窦房结自律活动减慢45.4%;Cs(2 mmol/L)阻断If通道后,心率减少26.8%;Ni(100 μmol/L)阻断T型钙通道后,自律活动减少14.3%.联合运用2种通道阻断剂,留下所观察的通道,得出类似的结果.结论对窦房结细胞起搏作用大小的次序为IK、超极化激活的起搏离子流If和T型钙通道电流ICa.T.
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温度对心脏自律性的影响机制
目的探讨温度对心脏自律性的影响机制.方法心率变异性(HRV)功率谱分析、细胞内动作电位记录和放射免疫法测窦房结组织内环-磷酸腺苷(cAMP)含量.结果温度变化前后,人和家兔的LF/HF都没有显著差异;温度升高,可使窦房结细胞动作电位的4期自动除极速率加快,窦房结组织内的cAMP含量增加;在窦房结主要离子流If、Ik、ICa.T中,If对温度的变化为敏感.结论温度对心率的影响并非通过神经因素,而是由温度对窦房结的直接作用所致,并且这一作用可能与cAMP对If电流的调控有关.
