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结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究
目的 研究pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用.方法 将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中,制备pcDNA3-Ag85B DNA疫苗.分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3-Ag85B免疫BALB/c小鼠,检测小鼠抗Ag85B抗体水平(ELISA)和体外特异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL-2、IL-4、 IL-10、 IFN-γ表达水平.结果 pcDNA3-Ag85B诱生的抗Ag85B效价明显高于生理盐水组和pcDNA3组;pcDNA3-Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下,IL-2和IFN-γ mRNA转录水平明显高于对照组,而IL-4和IL-10 mRNA转录水平在3组中无明显变化.结论 pcDNA3-Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫,亦可诱导Th1型细胞免疫.
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结核分支杆菌抗原85B DNA疫苗转染人气道上皮细胞对哮喘患者Th1/Th2平衡的调节作用
目的研究结核分支杆菌抗原85B(简称Ag85B)DNA疫苗经人气道上皮转化后的培养上清液对尘螨过敏哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2细胞因子释放的调控作用.方法亚克隆构建表达Ag85B基因的真核表达载体pMG-Ag85B,经脂质体介导转化离体培养气道上皮细胞16HBE,并收集转化细胞培养上清液,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转基因气道上皮Ag85B mRNA水平的表达,螨过敏哮喘组(18例)和正常组(13例)PBMC在离体单独与螨或与Ag85B转染上清液共同培养,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其培养上清液中白介素5(IL-5)、γ干扰素(IFN-γ)的水平.结果 RT-PCR法扩增转染的16HBE细胞中有992 bp长度的预期片断.无刺激状态下,哮喘患者和正常人PBMC培养上清液的IL-5、IFN-γ无差异,螨刺激可促进哮喘患者PBMC分泌IL-5,刺激和未刺激处理分别为(17.1±1. 9) pg/ml 和(11.9±0.9) pg/ml(P＝0.02);螨+Ag85B转染上清液与单纯螨刺激比较,前者IFN-γ水平显著高于后者,分别为(111.5±15.9) pg/ml和(58.8±7.8) pg/ml(P＝0.04), IFN-γ/IL-5的比值分别为7.2±4.8和4.9±2.5(P＝0.08).正常人不同刺激方法间比较,所有指标差异均无显著性(P＞0.05).结论螨过敏的变应性哮喘患者的PBMC在螨刺激下向Th2免疫反应偏移,在螨变应原存在时转化Ag85B基因的人气道上皮细胞培养上清液,能够诱导PBMC释放 IFN-γ,调节免疫反应向Th1方向偏移.
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结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究
目的构建编码结核分支杆菌(MTB)Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性.方法采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度.结果酶切鉴定重组表达质粒pTB30s构建成功;dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELJSA检测抗体几何平均滴度为1:120.结论应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病(TB)的防治研究.
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结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建
目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒.方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株.结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B.结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B.
