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轻型链球菌临床分离株psaA基因敲除株的构建及其毒力影响的初步研究
目的 构建轻型链球菌(S.mitis)临床分离株S.mitis008肺炎链球菌表面蛋白A(psaA)基因敲除菌株S.mitis00801,并检测其生长及毒力影响,为进一步分析轻型链球菌属细菌间psaA基因水平转移的功能学意义奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应技术(LFH-PCR)构建含红霉素耐药基因(erm)片段及psaA基因上、下游同源序列的连接片段,并转化至S.mitis008中,在含红霉素的平板上筛选psaA基因敲除菌株,并采用PCR鉴定；进一步观察psaA基因敲除株S.mitis00801体外生长情况,并利用小鼠模型观察S.mitis008和S.mitis00801鼻咽部定植能力的差异.结果 PCR结果均证实轻型链球菌psaA基因敲除菌株S.mitis00801构建成功；S.mitis008和S.mitis00801体外生长情况比较无差异；在轻链球菌CBA/n小鼠鼻咽部定植模型中,psaA基因敲除菌株S.mitis00801定植能力较未敲除株S.mitis008明显减少,存在统计学差异(P＜0.01).结论 LFH-PCR技术构建psaA基因敲除菌株S.mitis00801方法切实可行,psaA基因的敲除对细菌的体外生长无影响,但降低了细菌在体内鼻咽部定植的能力.
关键词： 肺炎链球菌表面蛋白A 轻型链球菌 基因敲除 鼻咽部定植 -
口腔轻型链球菌黏附性的研究进展
轻型链球菌是在口腔生物膜形成中的早期定植菌,通过黏附,产酸和耐酸,促进窝沟龋的发生.其中黏附是致龋的重要原因,本文就轻型链球菌的黏附性相关蛋白及基因作一综述.
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轻型链球菌缓解铜绿假单胞菌感染小鼠模型的炎症反应及机制的初步探讨
目的:探讨轻型链球菌(Streptococcus mitis,S.mitis)在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PAO1)感染小鼠模型中缓解炎症作用及可能机制.方法:将野生型和TLR2基因缺陷型小鼠随机分为4组,每组20只,通过气管内注入铜绿假单胞菌(PAO1组)、轻型链球菌(S.mitis组)、铜绿假单胞菌+轻型链球菌混合菌液(PAO1 +S.mitis组)和生理盐水(PBS组)建立模型,HE染色观察肺组织病理学改变,ELISA检测肺泡灌洗液中炎症因子白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达,计数肺泡灌洗液细胞总数及细胞分类.结果:野生型小鼠中肺组织病理学显示:PAO1组肺泡间隙增宽明显,有大量炎症细胞浸润,PAO1+S mitis组炎症较PAO1组稍轻;S.mitis组和PBS组肺组织结构正常,基本未见炎症 细胞浸润;肺泡灌洗液中PAO1组IL-6和TNF-α的含量高于PAO1 +S.mitis组(P=0.032,P=0.007),S.mitis组和PBS组仅有少量表达;PAO1组BALF细胞总数及中性粒细胞计数均较PAO1+S.mitis组、S.mitis组和PBS组增加(均P＜0.05).TLR2基因缺陷型小鼠中肺组织病理学显示:PAO1组和PAO1 +S.mitis组均有肺泡间隙增宽,炎症细胞浸润,肺泡灌洗液中PAO1组和PAO1+S.mitis组IL-6和TNF-α的表达没有统计学差异(P=1.000,P=1.000),S.mitis组和PBS组仅有少量表达;PAO1组和PAO1+S.mitis组支气管肺泡灌洗液细胞总数及中性粒细胞计数没有统计学差异(P=1.000,P=1.000).结论:轻型链球菌可缓解铜绿假单胞菌炎症反应与TLR2有关.
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铜绿假单胞菌与轻型链球菌混合生物膜体外模型的建立
目的 探索混合细菌生物膜(biofilm,BF)培养的适宜条件,建立混合细菌BF体外模型,并为研究混合细菌BF的调控机制奠定基础.方法 分别培养铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1、轻型链球菌(Streptococcus mitis)标准株ATCC49456.紫外分光光度计、CCK-8(cell counting kit-8)比色法比较2种细菌在不同pH值、培养基、混合比例、加入顺序和混合时间条件下的生长情况.建立单独及混合细菌BF后,荧光探针SYTO9/PI标记,激光共聚焦显微镜(confocal laserscanningmicroscopy,CLSM)观察BF内部活死菌比例.扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察BF结构.结果 pH值为7.5适宜2种细菌生长,P＜0.01:2种细菌在脑心浸出液培养基中生长明显优于胰大豆蛋白胨肉汤培养基,P＜0.01;PAO1与Smitis以1:3混合,且PAO1优先加入,能形成较好的BF,P＜0.01;2种细菌混合的时机以PAO1培养后立即混合Smitis为优,P＜0.01.CLSM结果显示PAO1可形成成熟致密的BF;S.mitis单独培养不形成BF;混合细菌BF较单独PAO1组活菌比例增多,3组厚度分别为(19.02±1.298)μm,(2.250±0.25)μm和(28.76±3.472)μm,P＜0.05.SEM显示混合细菌BF内两种细菌共存,结构更加致密立体.结论 成功建立PAO1混合Smitis的BF体外模型,方法简便易行,结果可靠,重复性强.初步证实S.mitis可参与混合菌BF形成,并起促进作用.
