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真皮多功能干细胞尾静脉输注后在放创复合伤大鼠体内分布的定量分析及其促愈作用
目的:定量分析尾静脉输注的真皮多功能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSC)在放创复合伤大鼠体内的分布,并观测其对创面愈合的作用.方法:体外分离培养大鼠dMSC并用3H-TdR标记,经尾静脉注射入大鼠体内后,液闪法测量各组织器官内细胞的分布;同时观察其对创面愈合的作用.结果:伤后1周始,复合伤组创面和骨髓dMSC含量明显高于正常对照组(P＜0.01),而肺脏、肝脏等组织器官dMSC含量在两组之间无明显差异(P＞0.05);伤后3周和4周,复合伤组大鼠创面和骨髓单位重量组织dMSC含量明显高于肺脏、肝脏等组织.细胞输注组创面残留面积从伤后15d开始明显小于无细胞输注组(P＜0.05).结论:静脉输注的dMSC可偏向性分布于损伤较重的皮肤创面和骨髓,并可明显地促进创面愈合.
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创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞差异表达cDNA文库的构建
目的:研究创伤早期伤口液作用前后真皮多能干细胞基因表达的变化,探讨真皮多能干细胞参与创伤修复启动的分子机制.方法:取伤后1d伤口液作为创伤修复启动微环境,刺激真皮多能干细胞,24h后提取总RNA为实验方(tester),未予刺激的真皮多能干细胞总RNA为驱动方(driver).实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA方法合成cDNA,然后用抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物.消减杂交产物克隆到T载体构建消减文库.对部分克隆进行杂交筛选及序列比对.结果:消减杂交文库挑取615个克隆进行PCR扩增,阳性率约为97%.取其中48个克隆进行反向Northern杂交,获得5个差异表达基因.经Genebank检索,这些差异表达基因与已知序列有较高同源性,其中大多为与创伤修复相关的基因.结论:我们成功构建了创伤早期伤口液刺激前后大鼠真皮多能干细胞差异表达cDNA文库,并筛选、克隆出部分与真皮多能干细胞参与创伤修复相关的差异表达基因.
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CXCR4基因转染促进移植dMSCs向放创复合伤大鼠创面分布的研究
目的 探讨CXCR4腺病毒表达载体(Adv-CXCR4)转染的真皮多能干细胞(dMSCs)移植后可否更多地向放创复合伤大鼠创面分布,并加速创面愈合.方法 3H-TdR标记Adv-CXCR4转染的dMSCs(A组)、绿色荧光蛋白腺病毒表达载体转染的dMSCs(B组)、未转染病毒载体的dMSCs(C组)后移植到放创复合伤大鼠体内,液闪法测量创面中dMSCs的含量.用生物医学图像分析仪测量伤后创面残留面积.结果 从伤后5 d起,A组创面中dMSCs的含量约占移植细胞总量的1.95%～3.85%,明显高于B组和C组(占移植细胞总量的1.07%～1.86%).从伤后12 d开始,A组刨面残留面积明显小于B组和C组.A组创面愈合时间比B组和C组提前约1.5 d.结论 Adv-CXCR4转染的dMSCs在移植后可更多地分布到放创复合伤大鼠的创面,且能更快地促进创面愈合.
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放创复合伤大鼠伤口液对真皮多能干细胞的趋化作用
目的观察放创复合伤大鼠伤口液对真皮多能干细胞(dMSCs)的趋化作用以及dMSCs对创面愈合的作用.方法采用Transwell培养体系,观察伤口提取液对dMSCs的趋化作用.用3H-TdR标记dMSCs,经尾静脉输入大鼠体内,液闪法测量各组织内dMSCs的含量.用生物医学图像分析仪测量伤后创面残留面积.结果在伤口液的作用下,复合伤组Transwell培养小室内上层细胞迁移到下层的明显多于正常组织液组和生理盐水组(P<0.01).伤后1周,复合伤组创面皮肤dMSCs含量明显高于正常对照组(P<0.01);伤后3和4周,复合伤组单位重量创面组织dMSCs含量明显高于同组的肺脏、肝脏等组织.伤后15 d开始,dMSCs输注组创面残留面积明显小于复合伤对照组(P<0.05). 结论放创复合伤大鼠伤口提取液对dMSCs有很强的趋化作用,进而促进静脉输注的dMSCs偏向分布于创面,并促进其愈合.
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移植dMSCs向放创复合伤创面优势分布的机制研究
目的 探讨静脉输注的真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)向放创复合伤大鼠创面优势分布的机制.方法 RT-PCR和免疫组织化学检测创面中基质细胞源性细胞因子(stromal-dereivedfactor-1,SDF-1)的表达水平,以及dMSCs中SDF-1受体CXCR4的表达水平.Transwell培养体系中,观察SDF-1对dMSCs的趋化作用.结果 放创复合伤大鼠创面SDF-1的表达水平明显高于正常大鼠,同时dMSCs表达CXCR4.体外趋化实验发现,SDF-1对dMSCs有很强的趋化作用,而使用SDF-1的中和性抗体后,放创复合伤大鼠伤口液对dMSCs的趋化作用明显下降(P＜0.05).结论 放创复合伤大鼠创面上调表达的SDF-1在移植dMSCs向创面的优势分布中有重要作用.
关键词： 真皮多能干细胞 放创复合伤 分布 基质细胞源性因子-1 -
脊髓损伤后真皮多能干细胞移植时机的选择
目的:观察脊髓损伤后不同时间移植真皮多能干细胞对大鼠运动功能修复的影响.方法:实验于2006-06/2007-03在第三军医大学生理学教研室完成.①实验材料:实验动物2～4月龄SPF级SD大鼠,体质量(210±40)g,雌雄不限,由第三军医大学实验动物中心提供.真皮多能干细胞为第三军医大学防原医学系从SD大鼠真皮中提取和分离.②实验方法:将42只SD大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型.将动物随机分为对照组(n=6)、真皮多能干细胞移植组(n=36).真皮多能干细胞移植组又分为6个时间点:损伤后1,4,7,10,14,21 d移植组,每组6只.各移植组于伤处移植大鼠真皮多能干细胞,而对照组于损伤后7 d注射等量磷酸盐缓冲液.③实验评估:分别于移植后1 d、1周、4周、8周、12周对各组大鼠进行动物行为学和脊髓诱发电位检测.结果:42只实验大鼠均进入结果分析,无脱落.①动物行为学评分:4周以后各组动物行为学评分比较差异有显著性意义(P＜0.05),移植组明显高于对照组(P＜0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10 d移植组动物行为学评分改善显著.②各组大鼠脊髓诱发电位检查:体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值于移植后8,12周后明显高于对照组(P＜0.05),各移植组间比较,以损伤后7,10 d移植组体感诱发电位和运动诱发电位潜伏期和波幅值改善显著.结论:脊髓损伤后7～14 d进行真皮多能干细胞移植可明显改善大鼠后肢的运动功能.
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含核受体真核表达载体的构建及其转染真皮多能干细胞
背景:研究表明含核受体基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因.目的:拟构建含核受体真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,并筛选出能稳定表达含核受体的真皮多能干细胞.设计、时间及地点:细胞基因学实验,于2007-03/12在解放军第三军医大学基础医学部病原生物学教研室完成.材料:成年SD大鼠1只,由解放军第三军医大学实验动物研究所提供;真皮多能干细胞由解放军第三军医大学全军复合伤研究所分离培养;质粒载体pEGFPN1及细菌DH5α由徐文岳教授惠赠.方法:首先以大鼠的大脑组织总RNA为模板,RT-PCR扩增出含核受体的编码cDNA序列,T/A克隆至pMD18-T载体上,然后用BamHI、HindⅢ双酶切释放出经测序鉴定为阳性的重组质粒pMD18-T-TLX中的含核受体片段,亚克隆到真核载体pEGFPN1中,从而构建真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,后采用阳性脂质体将pEGFPN1-TLX转染到真皮多能干细胞中.主要观察指标:转染后24 h荧光显微镜下观察绿色荧光,RT-PCR检测含核受体mRNA的表达,免疫组化染色观察向神经细胞的分化情况.结果:PCR、酶切和测序结果证明,成功地将含核受体全长cDNA克隆到pEGFPN1质粒中,并成功构建pEGFPN1-TLX重组质粒.与未转染真皮多能干细胞相比,10 d后可见pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞继续生长,并于15 d时形成抗性克隆,荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;而未转染的真皮多能干细胞10 d时已全部死亡.RT-PCR结果显示,pEGFPN 1-TLX转染真皮多能干细胞表达TLXmRNA.诱导后3d与单纯真皮多能干细胞比较,pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞诱导成NF200阳性细胞数明显增加,诱导成GFAP阳性细胞数明显减少.结论:实验成功构建含核受体真核表达载体,并成功转染了真皮多能干细胞.转染后能明显提高真皮多能干细胞向神经元分化的效率,而向胶质细胞分化受到抑制.
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转染Netrin-1基因的真皮多能干细胞治疗大鼠脊髓损伤的研究
目的:观察转染Netrin-1基因的真皮多能干细胞(dMSCs)移植对大鼠脊髓损伤的修复作用.方法:取大鼠真皮组织,分离培养真皮多能干细胞,经转染Netrin-1基因和诱导,观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定.Wistar大鼠在L4水平制成脊髓全横断损伤模型,伤处移植大鼠真皮多能干细胞或者转染Netrin-1基因的真皮多能干细胞.对大鼠进行动物行为学(BBB)评分和对损伤脊髓进行组织学检测.结果:转染Netrin-1基因的dMSCs诱导产生的神经元样细胞占总细胞数的比例为24.45±3.73%,而单独的真皮多能干细胞诱导产生的神经元样细胞占总细胞数的比例10.50±2.13%,二者差异显著(P<0.05).BBB评分显示转染Netrin-1基因的dMSCs移植组明显高于单纯dMSCs移植组和空白对照组(P<0.05);转染Netrin-1基因的dMSCs移植组损伤脊髓结构的修复明显优于单纯dMSCs移植组和空白对照组.结论:转染Netrin-1基因的真皮多能干细胞移植较单纯dMSCs移植对大鼠脊髓损伤有更好的治疗作用.
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白细胞蛋白酶抑制因子在真皮多能干细胞中的表达
目的研究白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)在真皮多能干细胞中的表达以及同伤口液刺激的关系.方法采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞,收集伤后1 d伤口液,比较伤口液刺激前后真皮多能干细胞和创伤前后大鼠皮肤组织中SLPI mRNA表达的变化.通过Western blot了解伤口液刺激前后真皮多能干细胞中SLPI蛋白表达的变化.结果分离、纯化的真皮多能干细胞形态较为均一,增殖能力强,RT-PCR和Western blot提示,SLPI在真皮多能干细胞中表达,伤口液刺激后表达增强.同时检测到SLPI在创伤后1 d大鼠皮肤组织中表达升高.结论SLPI高表达可能是真皮多能干细胞参与创伤修复的重要途径之一.
关键词： 白细胞蛋白酶抑制因子 真皮多能干细胞 表达 -
人真皮多能干细胞移植后在缺血性损伤脑组织中的迁移与分布
目的 探讨经股静脉移植的大鼠真皮多能干细胞在缺血性损伤脑组织中的存活、迁移及分布情况.方法 分离培养人真皮来源的多能干细胞(skin-derived precursors,SKPs),采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血冉灌注模型,缺血2h后行再灌注,于再灌注24h后将CM-DiI标记的人真皮来源的SKPs经大鼠股静脉输入动物模型体内,植入后分别在第1、3、5d处死大鼠,作冰冻切片,采用免疫组织荧光染色法,检测SKPs在脑缺血大鼠体内的存活、迁移及分布情况.结果 在移植了SKPs后的MCAO大鼠脑组织冰冻切片中,荧光显微镜下可见移植的SKPs.静脉移植的细胞主要分布在缺血灶的周围,健侧脑组织中偶见移植细胞.结论 经股静脉移植的SKPs,能够在宿主缺血的脑组织中存活,并向损伤部位迁移.
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真皮多能干细胞复合聚乳酸支架修复关节软骨全层缺损的实验研究
[目的]探讨真皮多能干细胞在软骨缺损修复中的可行性,为扩大软骨缺损修复中种子细胞的选择提供实验依据.[方法]以新生青紫蓝兔为研究对象,机械法直接分离得到真皮组织,采用酶消化法获取细胞,利用干细胞贴壁粘附生长的特性获取高克隆细胞群,并进行传代培养.使细胞浓度达到1×106/ml与聚乳酸支架材料共培养一周后植入兔膝关节软骨全层缺损处,用3～5个月龄青紫蓝兔30只,60个关节,随机分为真皮多能干细胞/聚乳酸支架材料、聚乳酸支架材料、空白对照三组,每组20个关节,于术后12周空气栓塞处死实验兔,对修复组织进行取材,行HE、甲苯胺蓝染色,根据软骨缺损修复情况进行大体、组织学评分,并进行统计学分析,比较各组的评分差异是否具有统计学意义.[结果]大体及组织学观察显示,真皮干细胞/支架材料实验组修复组织表面光滑、呈透明样,与周围软骨及软骨下骨整合良好,而聚乳酸支架材料组有少许透明样软骨,主要以纤维软骨修复,空白对照组则表面有缺损,以纤维软骨修复.大体及组织学观察后进行统计学评分分析,显示A组修复效果优、优于B、C组(P＜0.05),B组优于C组(P＜0.05)[结论]真皮多能干细胞修复关节软骨缺损效果明显,恢复正常关节软骨结构,可作为组织工程化软骨种子细胞之一.
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真皮多能干细胞与聚(对苯二甲酸丁二醇酯-co-聚乙二醇-co-低聚乳酸)三元共聚酯的生物相容性
目的 观察小鼠真皮多能干细胞(SKP)与聚(对苯二甲酸丁二醇酯-co-聚乙二醇-co-低聚乳酸)(PBTEOLA)三元共聚酯的生物相容性.方法 分离培养小鼠乳鼠SKP.用DAPI标记SKP细胞核后,荧光显微镜下动态观察SKP接种在共聚酯支架上的生长情况;SKP与共聚酯体外立体培养至第4天和第7天时,通过扫描电镜及苏木素-伊红(HE)染色观察细胞生长及基质分泌情况;噻唑蓝(MTY)比色法检测共聚酯对SKP的增殖影响.结果 SKP细胞接种于共聚酯上24 h后即贴壁生长,第5～7天时为生长高峰.SKP牢固地黏附于共聚酯材料表面和孔隙内,细胞间有伪足相连,且有基质形成.检验时间因素和材料因素交互作用时,差异无统计学意义(P＞0.05).共聚酯对细胞生长无明显影响.结论 PBTEOLA三元共聚酯对SKP细胞具有良好的生物相容性,可选择作为组织工程的支架材料.
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NOV基因真核表达载体的构建及在大鼠真皮多能干细胞中的表达
目的 构建肾母细胞瘤过度表达(NOV)基因真核表达载体并检测其在真皮多能干细胞中的表达. 方法 利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,以新生大鼠大脑组织总RNA为模板,扩增出1 178bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后定向克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒中,用脂质体法将重组质粒转染入大鼠真皮多能干细胞中,荧光显微镜观察转染产物,RT-PCR法检测转染细胞中NOV基因表达. 结果 NOV基因cDNA正确克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中;重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后,可见转染细胞有绿色荧光表达.转染细胞中检测到NOV基因. 结论 构建成功NOV基因重组质粒,并能在大鼠真皮多能干细胞中稳定表达,为NOV基因及真皮多能干细胞的作用研究提供了有利的分子工具.
关键词： NOV基因 逆转录-多聚酶链反应 基因克隆 真皮多能干细胞 -
CXCR4基因转染促进移植真皮多能干细胞向全身照射大鼠骨髓分布的研究
目的:观察CXCR4腺病毒表达载体(adenovirus vector of CXCR4,Adv-CXCR4)转染的真皮多能干细胞(dermal muhipotent stem cells,dMSCs)移植后可否更多地向全身照射大鼠骨髓分布,并加速骨髓造血功能恢复.方法:3H-TdR标记Adv-CXCR4转染的dMSCs(A组)、绿色荧光蛋白腺病毒表达栽体转染的dMSCs(B组)、未转染病毒栽体的dMSCs(C组)后移植到全身照射大鼠体内.液闪法测量骨髓中dMSCs的含量.监测血中红细胞等的恢复情况.结果:伤后5 d起,A组骨髓中dMSCs的含量明显高于B组和C组(P<0.05).伤后14 d和21 d.A组红细胞、白细胞和血小板的数量明显高于B组和C组(P<0.05).结论:Adv-CXCR4转染的dMSCs在移植后可更多地分布到全身照射大鼠的骨髓,且能更快地促进骨髓造血功能的恢复.
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RNA解旋酶p68在真皮多能干细胞增殖调控中的作用
目的 研究RNA解旋酶p68在真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells, DMSCs)增殖过程中的表达特点,并探讨其在创伤愈合中的意义.方法 通过免疫细胞化学和Western blot方法检测p68在DMSCs不同生长状态的表达特点,早期伤口液刺激对DMSCs中p68表达的影响并通过MTT法检测DMSCs增殖的变化,进一步通过RNAi抑制p68表达之后检测细胞增殖的变化特点.结果 增殖活跃的DMSCs中p68表达较强,饥饿以后,p68表达降低;伤后1 d伤口液可明显促进DMSCs中p68的表达及细胞增殖(P<0.01);RNAi抑制p68表达之后DMSCs增殖明显受抑(P<0.01).结论 RNA解旋酶p68参与DMSCs的增殖调控,创伤微环境在修复细胞的启动中可能发挥作用.
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大鼠SLPI基因siRNA重组表达载体构建及其在调控真皮多能干细胞增殖中的作用
目的 观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用.方法 酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs.在前期成功构建SLPI基因过表达载体基础上,根据SLPI基因siRNA的设计挑选出佳抑制SLPI基因表达的干扰载体,RT-PCR、Western blot鉴定.重组表达载体转染DMSCs,观察其表达,运用CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期,观察SPLI基因促进DMSCs的增殖作用.结果 成功分离获得真皮来源、具有细胞干性的DMSCs;并成功构建SLPI基因过表达真核载体及SLPI基因siRNA表达载体,转染DMSCs(分为过表达组和干扰组,并以转染空载体者为对照组).CCK-8检测显示,48、72、96 h,过表达组增殖较快,干扰组增殖较慢,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);72、96 h,过表达组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),说明过表达组增殖较快,即SLPI基因有促进增殖作用.流式细胞检测表明,过表达组G1期与干扰组比较差异有统计学意义(P＜0.05),S期、G2期与对照比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SLPI基因具有明确的促DMSCs增殖作用,促进细胞从G1向S和G2期转变,即通过调控细胞周期发挥促增殖作用.
关键词： 分泌型白细胞蛋白酶抑制因子 重组表达载体 真皮多能干细胞 增殖 -
hBD2修饰真皮多能干细胞促进感染创面修复的初步实验研究
目的观察人β防御素2(human β-defensin 2,hBD2)修饰的大鼠真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)移植后对细菌感染创面修复的影响.方法制作大鼠全层皮肤切割伤伴感染模型,点状注射的方法将hBD2腺病毒载体转染修饰的dMSCs移植到伤口,通过测定痂下菌量及创面愈合面积百分率和创面愈合时间等评价hBD2修饰的dMSCs局部移植的促愈效果.结果和局部单纯移植dMSCs组和单纯损伤组相比,hBD2修饰的dMSCs移植组痂下菌含量低(P＜0.05),且创面愈合时间明显缩短(P＜0.05).结论hBD2修饰的dMSCs可有效地促进大鼠感染创面的修复.
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重组人β防御素2在真皮多能干细胞中的表达及抗菌活性的测定
目的检测重组人β防御素2(human β-defensin 2, hBD2)腺病毒表达载体在大鼠真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells, dMSCs)中的表达,并观察重组hBD2的体外抗菌活性.方法将含有hBD2重组腺病毒转染dMSCs,RT-PCR、荧光免疫化学、Western blotting检测hBD2的表达情况,ELISA测定培养上清中hBD2的浓度,K-B纸片扩散法检测上清对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等标准菌株的杀灭效果.结果 RT-PCR、荧光免疫化学和Western blotting的结果显示转染后hBD2可在dMSCs中有效地表达,上清中hBD2的浓度为743.6 ng/ml,K-B纸片法显示HBD2对上述标准菌株有明显的杀灭效应.结论 hBD2重组腺病毒表达载体在dMSCs可高效表达,并对大肠埃希菌等标准菌株有杀灭效应.
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创伤早期伤口液对体外培养真皮多能干细胞增殖迁移特性的影响
目的 探讨真皮多能干细胞在创伤修复启动中的作用.方法 采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞;利用四唑盐比色试验(MTT法)检测不同时间、不同浓度伤口液对上述细胞的影响.在此基础上,观察伤后1 d伤口液对真皮多能干细胞贴壁力和迁移力等与创伤修复密切相关的指标变化.结果 伤后不同时相不同浓度伤口液对真皮多能干细胞增殖均具有显著刺激作用,但以伤后早期的伤口液作用为明显.成纤维细胞和血管内皮细胞对伤口液反应均显著弱于真皮多能干细胞.伤口液作用后真皮多能干细胞贴壁力和迁移能力较对照组细胞显著增加.结论 真皮多能干细胞是创伤愈合,特别是创伤修复启动过程中的一种重要的间充质干细胞,对其深入研究有望为阐明创伤修复启动分子机制提供依据.
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真皮多能干细胞移植后向全身照射大鼠骨髓优势分布的机制研究
目的探讨静脉输注的真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)向全身照射(total body irradiation,TBI)大鼠骨髓优势分布的机制.方法 RT-PCR和荧光免疫化学检测骨髓中基质细胞源性细胞因子(stromal-derived factor-1,SDF-1)的表达水平,以及dMSCs中SDF-1的受体CXCR4的表达水平.Transwell培养体系中,观察SDF-1对dMSCs的趋化作用.结果 TBI大鼠骨髓SDF-1的表达水平明显高于正常大鼠,同时dMSCs表达CXCR4.体外趋化实验发现,SDF-1对dMSCs有很强的趋化作用,而使用SDF-1的中和性抗体后,TBI大鼠骨髓提取液对dMSCs的趋化作用明显下降(P<.05).结论 TBI大鼠骨髓局部上调表达的SDF-1在移植dMSCs向骨髓的优势分布中有重要作用.
关键词： 真皮多能干细胞 全身照射 分布 基质细胞源性因子-1
