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LAMP2单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的:制备抗-lamp2单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法:根据已发表的文献通过人工合成多肽,并将此多肽分别连接KLH和BSA,以peptide-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠,取血清效价大于 1:10000 的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 进行融合,以peptide-BSA包被,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测杂交瘤细胞的上清进行筛选;得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,采用免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别目的蛋白.结果:得到一株能稳定分泌抗-LAMP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,应用免疫组化方法证明新制备的抗-LAMP2单克隆抗体能识别天然的 LAMP2;此单克隆抗体的亚类为.结论:杂交瘤细胞株能稳定分泌目的单克隆抗体;免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别自己天然的目的蛋白,为更好地研究LAMP2的生物学功能奠定了基础.
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miR-145-3p在多发性骨髓瘤中表达及其对多发性骨髓瘤细胞凋亡与自噬作用机制的研究
目的 探讨微小mRNA-145-3p(miR-145-3p)在多发性骨髓瘤( MM)中表达及其对MM细胞凋亡与自噬作用机制.方法 2014年6月至2017年5月我院收治的MM患者60例( MM组)、健康体检者30例(正常组),采用荧光定量PCR法检测两组血浆样本及细胞株(MM细胞株选择U266、RPMI-8266、LP-1、H929,以CD138+浆细胞为对照组)中miR-145-3p表达水平,后选择毒性低的MM细胞株(LP-1)进行miR-145-3p mimic或inhibitor转染(分别为mimic组、inhibitor组),并设立对照,以流式细胞仪进行凋亡检测[吸光度值(OD值)],并采用westren blot检测转染细胞凋亡与自噬相关标志物[肿瘤蛋白21(P21)、unc-51样激酶1(ULK1)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)].结果 MM组血浆及细胞株(U266、RPMI-8266、LP-1、H929)中miR-145-3p水平均低于正常组(P＜0.05);转染后随时间延长,OD值均增加,且转染后3 d及5 d OD值大小均为mimic组＜对照组＜inhibitor组;mimic组P21水平高于inhibitor组及对照组,ULK1、LAMP2水平低于inhibitor组及对照组( P＜0.05).结论 miR-145-3p在MM中呈低表达,可能通过靶向调控P21/ULK1/LAMP2信号通路而抑制细胞凋亡,促进细胞自噬.
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LAMP2抑制肝癌细胞增殖的机制
目的:探索LAMP2分子对肝癌细胞增殖的影响及其机制.方法:首先利用Western blot及QT-PCR技术检测在不同肝癌细胞系中LAMP2分子的表达水平,然后选择一种肝癌细胞系HepG2进行慢病毒转染以建立LAMP2沉默的稳定细胞系HepG2-9455.利用MTT法对比LAMP2沉默细胞系和未沉默细胞系细胞的增殖情况.检测其可能影响的几个关键信号通路分子如PI3K、AKT、NF-κB、ERK等以明确其作用机制.结果:LAMP2在各肝癌细胞系中普遍表达较高,其在正常肝组织中主要分布于胆管周围并且呈极性分布,然而在肝癌组织中LAMP2的定位却发生了紊乱.通过慢病毒构建的稳定细胞系HepG2-9455其LAMP2表达下降了90%,而在下调LAMP2后可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖.并且在下调LAMP2分子后HepG2细胞的PI3K、AKT和NF-κB分子发生明显下调.结论:LAMP2分子可以通过调节下游的PI3K、NF-κB(p-p65)分子而影响肿瘤细胞的增殖.提示LAMP2分子在肝癌的恶性进展中可能发挥了重要的作用.
