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干扰SEDL基因表达对软骨细胞生理活性的影响
目的 初步研究干扰SEDL基因表达后对人软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白表达水平、内质网位置分布及超微结构和软骨细胞活性的影响.方法 将靶向干扰SEDL基因的病毒转染入人软骨细胞中,QPCR及Western Blot分别检测SEDL基因及Sedlin蛋白表达水平,评价干扰SEDL基因的软骨细胞模型是否建立成功;免疫荧光及Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白表达情况,荧光探针检测内质网位置分布改变,电镜检测内质网超微结构改变,MTT法检测软骨细胞增殖活性情况.结果 (1)转染干扰SEDL基因病毒的软骨细胞SEDL基因表达明显降低,具有统计学差异(P＜0.05).Sedlin蛋白表达降低,表明干扰SEDL基因的细胞模型构建成功.(2)随着Sedlin蛋白的减少,Ⅱ型胶原蛋白表达量降低,具有统计学差异(P＜0.05).(3)细胞模型中内质网分布发生改变,其形态变圆,触角变少,颜色变淡,细胞与细胞间内质网荧光排列不规则,紊乱.(4)电镜下观察,细胞模型中内质网超微结构出现水肿扩张.(5)转染干扰SEDL基因病毒的软骨细胞活性在48 h达峰,之后细胞活性下降,且具有统计学差异(P＜0.05).结论 Sedlin降低影响软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达,软骨细胞中内质网形态位置分布及超微结构发生改变,致使软骨细胞活性降低.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 SEDL基因 Sedlin 软骨细胞 -
骨发育相关基因在SEDT中差异表达的研究
目的:分别靶向增强和干扰人软骨细胞(human chondrocytes-articular,HC-a)X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)基因,骨再生PCR芯片检测细胞内骨发育相关基因表达变化,观察干扰后基因表达谱的变化.方法:分别转入前期构建的靶向增强SEDL的腺病毒质粒pAd5-SEDL和靶向干扰SEDL的慢病毒质粒LV-siSEDL到293T细胞包装成重组腺病毒pAd5-SEDL和重组慢病毒LV-siSEDL,扩增重组腺病毒,收集病毒液,检测病毒滴度.将重组腺病毒、重组慢病毒以适感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别感染HC-a,实验分4组:增强组(HC-a/pAd5-SEDL,重组腺病毒pAd5-SEDL感染HC-a增强SEDL基因表达)、增强阴性对照组(HC-a/空载体(pAd5),空白腺病毒pAd5感染HC-a作阴性对照)、干扰组(HC-a/LV-siSEDL,重组慢病毒LV-siSEDL感染HC-a干扰SEDL基因表达)、干扰阴性对照组(HC-a/空载体(LV),空白慢病毒LV感染HC-a作阴性对照),通过QPCR检测HC-a中SEDL基因表达、Western blot检测HC-a中sedlin蛋白表达,验证是否成功干扰或增强SEDL基因表达,收集4组细胞mRNA进行骨再生PCR芯片(含84个基因)检测.结果:(1)收获高滴度重组腺病毒pAd5-SEDL,病毒滴度为2.6×1011 pfu/ml.并使重组腺病毒pAd5-SEDL和重组慢病毒LV-siSEDL成功感染HC-a.(2)HC-a SEDL基因表达量中增强组(2.14±0.36)较增强阴性对照组(1.21±0.25)增高(-0.022),干扰组(0.86±0.11)较干扰阴性对照组(1.34±0.06)降低(P=0.003);sedlin蛋白表达量中,增强组(0.56±0.04)较增强阴性对照组(0.37±0.05)增高(P=0.006),干扰组(0.13±0.02)较干扰阴性对照组(0.36±0.04)降低(P=0.001).(3)基因芯片结果:HC-a内SEDL基因干扰后,芯片结果显示:基因上调21个,下调5个.HC-a内SEDL基因增强后,骨再生PCR芯片结果显示:基因上调27个,下调12个.干扰组的差异表达基因中,在增强组中呈反向变化,且与软骨发育相关的基因有5个:COL2A、BMP3、FLT1、GDF10、IGF1.结论:通过增强及沉默软骨细胞内SEDL基因,发现骨发育相关基因中COL2A、BMP3、FLT1、GDF10、IGF1出现差异表达,可能与SEDL基因有关联.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 基因芯片 基因重组病毒 -
X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系的早期产前基因诊断
目的 联合应用性别鉴定、连锁分析和致病基因检测三种方法对X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系进行产前基因诊断.方法 收集1个SEDL家系的7位成员(先证者、3名携带者及3名健康成员)外周血2 mL,抽取2位胎儿的羊水标本20 mL.用聚合酶链反应扩增2位胎儿的SRY基因和AMEL基因进行性别鉴定;应用PCR扩增产物双向直接测序方法检测SEDL基因突变;利用与SEDL基因毗邻的微卫星遗传标记DXS16进行连锁分析.结果 经SRY和AMEL基因性别鉴定2位胎儿均为男性,1位胎儿SEDL基因存在IVS2-2A→C突变,且具有与致病基因连锁的DXS16等位基因;另1名胎儿SEDL基因检测未发现上述突变,DXS16等位基因与呈野生型SEDL基因连锁.经随访,新生儿和引产胎儿的基因诊断结果与产前诊断一致.结论 SEDL基因突变检测结合微卫星DXS16多态性连锁分析和性别鉴定可以准确有效地进行X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系的产前诊断.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 产前诊断 性别鉴定 基因突变 连锁分析 -
X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变及基因诊断
目的 确定一个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系的基因突变类型;建立一种快速基因诊断方法.方法 采用体格检查、影像学检查及家系分析进行临床诊断.针对SEDL基因的第3～6外显子及其侧翼序列设计4对引物,建立基于PCR的变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)快速基因分型方法.常规酚-氯仿法从该家系3代18名成员的外周血中提取基因组DNA,经PCR/DHPLC分析,筛查出SEDL基因突变所在的片段,对该片段进行序列分析以确定突变位点及类型.结果 DHPLC分析发现该家系的SEDL基因突变位点在第4外显子片段,序列分析证实为c.218C》T突变,导致氨基酸序列S73L改变.在该家系的18名成员中,3例男性患者,5例女性肯定携带者和2例未婚女性携带者均带有该突变,其余表型正常的8名成员中未检测到这一突变.各成员的DHPLC峰型所代表的基因型与表型结果相吻合.结论 首次报告中国人SEDL基因c.218C》T突变,丰富了中国人SEDL基因的突变谱.采用的技术快速、可靠,能对SEDL进行快速基因分型和产前诊断.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 变性高效液相色谱 基因突变 -
X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变及基因诊断
目的 确定一个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系的基因突变类型;建立一种快速基因诊断方法.方法 采用体格检查、影像学检查及家系分析进行临床诊断.针对SEDL基因的第3～6外显子及其侧翼序列设计4对引物,建立基于PCR的变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)快速基因分型方法.常规酚-氯仿法从该家系3代18名成员的外周血中提取基因组DNA,经PCR/DHPLC分析,筛查出SEDL基因突变所在的片段,对该片段进行序列分析以确定突变位点及类型.结果 DHPLC分析发现该家系的SEDL基因突变位点在第4外显子片段,序列分析证实为c.218C》T突变,导致氨基酸序列S73L改变.在该家系的18名成员中,3例男性患者,5例女性肯定携带者和2例未婚女性携带者均带有该突变,其余表型正常的8名成员中未检测到这一突变.各成员的DHPLC峰型所代表的基因型与表型结果相吻合.结论 首次报告中国人SEDL基因c.218C》T突变,丰富了中国人SEDL基因的突变谱.采用的技术快速、可靠,能对SEDL进行快速基因分型和产前诊断.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 变性高效液相色谱 基因突变 -
X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因剪接受体突变导致潜在剪接位点激活
目的深入研究X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 (X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda, SEDL)的发病机理,为终防治本病提供依据.方法应用逆转录-PCR及克隆测序方法对1例涉及SEDL基因第5内含子剪接受体缺失的SEDL患者进行mRNA表达研究. 结果该患者存在2个不同片段长度的mRNA表达产物,与GenBank正常序列进行BLAST比较后发现,393 bp的表达产物是第6外显子内一个新的潜在剪接位点激活后形成的产物;433 bp的表达产物与8号染色体的部分基因组序列完全一致. 结论 SEDL基因第5内含子剪接受体位点及其后的第6外显子共13个碱基的缺失突变导致第6外显子内一个新的潜在剪接受体位点激活,使转录后的mRNA丢失了第6外显子内47 bp的编码序列,并使紧接其后的2个密码子产生移码,导致翻译的提前终止(D109-S123del;S124fsX126).另外,该突变可能激活了8号染色体上假基因SEDLP2的转录,从而部分地补偿了SEDL蛋白的功能.
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X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系基因突变研究
目的 研究X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)患者的发病机理,并探讨该病的快速基因诊断方法.方法 应用逆转录聚合酶链反应,结合序列分析方法,对一个X-SEDL家系2例患者及育龄女性进行SEDL基因突变分析.结果 cDNA序列分析显示患者为G209A突变,并对突变所在第4外显子进行PCR扩增并测序进一步证实.患者女儿为该突变的携带者.结论 由于SEDL基因较小,直接对患者提取总RNA,逆转录后直接进行PCR扩增、测序,可直接发现基因阅读框内的多种类型的突变,相对于针对每一个外显子单独扩增检测更加直接、快速.
关键词： X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 SEDL基因 基因诊断
