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重组腺相关病毒转导NIH3T3建立神经生长因子真核表达细胞株的研究
目的:探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)转导美国国家健康研究中心建系的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,NIH3T3)建立神经生长因子β(nerve growth factor subunitβ,NGFβ)真核表达细胞株可行性,并检测其生物活性.方法:使用表达NGFβ的重组腺相关病毒感染NIH3T3细胞,取感染重组病毒的3T3细胞培养基上清,经表达蛋白提取和浓缩,肝素-Sepharose CL-6B亲和层析柱的纯化;酶免疫斑点法检测表达蛋白的NGFβ抗原活性;Coomassic亮蓝G250法测定表达蛋白的浓度;十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfat-polyarylanide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析检测表达蛋白的分子量,计算表达蛋白占总蛋白的比率;鸡胚背根神经节突起生长实验和小鼠嗜铬瘤细胞(mouse adrenal pheochromocytoma cells,PC12)无血清培养生长刺激5溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyurididne,Brdu)掺入实验观察真核表达蛋白的生物学活性.结果:转导的3T3细胞具有13.6kd的表达蛋白,每升细胞培养基中可以获得400～500μg NGFβ蛋白,表达蛋白纯度可达95.4%以上.表达蛋白具有很强的NGF抗原活性.鸡胚背根神经节突起生长实验显示真核表达的NGFβ在10ng/ml时有明显的促进突起生长作用,PC12细胞的Brdu掺入实验显示当NGFβ的使用量达10ng/ml时达到大的平台期,生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×108BU(生物活性单位)/g.结论:使用重组腺相关病毒转导NIH3T3细胞可建立长期表达人NGFβ的NIH3T3细胞株,并表达出具有活性的NGFβ蛋白.
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重组人神经生长因子β基因腺病毒的构建与鉴定
目的 构建表达人神经生长因子β基因片段的重组腺病毒AdCMV-hNGF-β. 方法 以健康人白细胞中DNA为模板,扩增hNGF-β基因片段,导入pGEM-T-Easy质粒,获得重组质粒pGEM-T/hNGF-β.经酶切鉴定后与复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA构建重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-hNGF-β.酶切鉴定后再与辅助包装质粒PJM17共转染293细胞,经同源重组后,构建复制缺陷型重组腺病毒AdCMV-hNGF-β.对AdCMV-hNGF-β进行基因鉴定,并测定滴度及在HeLa细胞中的表达. 结果 顺利克隆出hNGF-β基因片段,构建的重组质粒pGEM-T/hNGF-β和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-hNGF-β,经酶切鉴定实际结果与理论推导符合.构建的复制缺陷型重组腺病毒AdCMV-hNGF-β滴度为1.2×1012pfu/ml,并能在HeLa细胞中表达. 结论 以hNGF-β基因片段为基础成功构建了重组腺病毒AdCMV-hNGF-β,测试表明该重组病毒具有高滴度活性和良好的感染人类细胞、表达目的蛋白的能力.
关键词： 人神经生长因子(hNGF) 基因表达 重组腺病毒
