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SUMO化调节在深低温停循环脑保护机制中的研究进展
深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)作为一种复杂的体外循环技术应用于复杂先心病矫治和大血管手术,目的是为外科医生提供清晰无血的术野.但应用DHCA需要完全阻断动脉血流,因此,会导致患者术后发生不同程度的一过性或永久性的神经功能障碍[1],主要包括术后精神错乱、焦虑、瞻望、意识不清、中风和昏迷等.有研究表明,DHCA后一过性和永久性的神经功能障碍的发生率高达8％和9.3％[2],因此,DHCA中如何避免和减轻缺血后脑损伤的研究成为目前研究的热点.传统的机制认为在DHCA过程中通过应用深度低温降低缺血神经细胞的能量代谢和低温状态下神经细胞的ATP损耗,但其详细机制未被完全阐明[3].
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构建一种精确表达小分子蛋白的技术平台
目的:克服原核表达的小分子蛋白难以去除附加氨基酸的问题,为基因工程精确表达小分子蛋白提供一种简便有效的解决方案.方法:以73个氨基酸的小分子蛋白(黑色素瘤生长激活因子CXCL1的功能区)为例,用PCR方法扩增了基因,TA克隆到载体PET SUMO.测序验证后的重组质粒转化至表达茵BL21(DE3)中诱导表达,融合蛋白用基质辅助解吸电离飞行时间质谱仪进行串联质谱鉴定(MALDI-TOF-MS/MS).通过特异性的SUMO蛋白酶酶解载体SUMO蛋白,利用SUMO蛋白和其蛋白酶带6x His标签的性质,经镍螯合柱亲和层析将二者去除,以Western blotting证明目的小分子蛋白的分离.结果:①经测序,重组质粒无突变,TA克隆方向正确,重组载体构建成功.②MALDI-TOF-MS/MS证明融合蛋白由SUMO蛋白和CXCLl蛋白组成,除去SUMO蛋白后的表达终产物经Westem blotting鉴定,与其相应的抗体有特异性结合,证明分离得到的小分子蛋白即为目的蛋白.结论:运用这一技术可将载体蛋白完全去除从而达到精确表达小分子蛋白的目的,在分子生物学的实验研究中有很好的应用前景.
