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胰腺癌细胞株PANC1异常甲基化miRNA的分析
目的 分析胰腺癌细胞株PANC1与正常胰腺组织表达有差异的启动子区甲基化miRNA,寻找与胰腺癌相关的高甲基化miRNA.方法 抽提PANC1与正常胰腺组织基因组DNA,超声断裂.应用抗5-甲基化嘧啶核苷抗体和免疫磁珠法获取甲基化DNA片段.通过DNA甲基化芯片筛选出PANC1与正常胰腺组织表达差异的高甲基化miRNA,采用重亚硫酸盐修饰的PCR (BSP)和TA克隆测序的方法进行验证.提取胰腺癌细胞株BxPC3、CFPAC1、PANC1、SW1990基因组DNA,采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)验证芯片筛选出的差异表达的甲基化miRNA.结果 PANC1细胞与正常胰腺组织存在8个差异表达的甲基化miRNA,从中挑选出5个进行BSP+ TA克隆测序验证,其中miR-615、miR-663、miR-663b在PANC1细胞的甲基化率明显高于正常组织(60.6％比7.6％,88.8％比22.2％,94.4％比13.0％)；miR-675的甲基化率与正常胰腺组织无明显差异(76.0％比100％)；miR1826因测序结果误差较大而舍去.经COBRA验证,PANC1的上述4种miRNA均高甲基化；BxPC除miR-675外,其他3种均高甲基化；CFPAC1的miR-663、miR-663b高甲基化；SW1990的miR-615、miR-663高甲基化.结论 胰腺癌细胞株与正常胰腺组织间存在差异表达的高甲基化miRNA,其中miR-663高甲基化与胰腺癌可能相关.
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雄激素非依赖性前列腺癌细胞株BCL2和GRB10基因启动子区甲基化研究
目的 探讨基因甲基化在雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer,AIPC)转化过程中可能的作用.方法 采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测雄激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC)细胞株LNCaP和雄激素非依赖性前列腺癌细胞株LNCaP-AI(androgen independent)中生长因子受体结合蛋白10(growth factor receptor-bound protein 10,GRB10)和B细胞性淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukaemia-2 gene,BCL2)的甲基化状态.结果 GRB10基因在LNCaP-AI细胞和LNCaP细胞中的甲基化率分别为9.6％、7.4％；BCL2基因在LNCaP-AI细胞和LNCaP细胞中的甲基化率分别为14.7％、25.3％,这两个基因在LNCaP细胞和LNCaP-AI细胞的甲基化率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 GRB10和BCL2基因的异常表达与基因甲基化无明显相关,而二者是否参与到前列腺癌激素非依赖性到转化过程以及具体机制有待进一步研究.
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人胸苷激酶基因cDNA克隆
目的克隆人胸苷激酶基因cDNA.方法采用逆转录PCR方法扩增胸苷激酶cDNA,用十二烷基氟波酯(TPA)刺激人外周血细胞的mRNA为模板;扩增的PCR产物经TA克隆重组和内切酶鉴定,以及DNA序列分析确定克隆基因的序列.结果经逆转录PCR扩增出一个700bp左右的DNA片段,TA克隆出现16个阳性克隆,选择其中的一个克隆(TKTA8)进行DNA序列分析,序列分析结果表明TKTA8克隆重组的序列是人胸苷激酶的cDNA序列.结论从外周血细胞中得到了hTK完整的开放读码框架.
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PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化
目的构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,并进行PEP-1-SOD1融合蛋白表达和纯化.方法以pBluescript Ⅱ SK-SOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1 cDNA.经酶切后,分别构建原核表达载体pET15b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coli BL21(DE3),表达SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白,并进行鉴定.结果 SDS-PAGE和Western blot分析表明,分别在相对分子质量22 000和26 000处出现SOD1和PEP-1-SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在.结论已成功地制备出SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白.
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构建一种精确表达小分子蛋白的技术平台
目的:克服原核表达的小分子蛋白难以去除附加氨基酸的问题,为基因工程精确表达小分子蛋白提供一种简便有效的解决方案.方法:以73个氨基酸的小分子蛋白(黑色素瘤生长激活因子CXCL1的功能区)为例,用PCR方法扩增了基因,TA克隆到载体PET SUMO.测序验证后的重组质粒转化至表达茵BL21(DE3)中诱导表达,融合蛋白用基质辅助解吸电离飞行时间质谱仪进行串联质谱鉴定(MALDI-TOF-MS/MS).通过特异性的SUMO蛋白酶酶解载体SUMO蛋白,利用SUMO蛋白和其蛋白酶带6x His标签的性质,经镍螯合柱亲和层析将二者去除,以Western blotting证明目的小分子蛋白的分离.结果:①经测序,重组质粒无突变,TA克隆方向正确,重组载体构建成功.②MALDI-TOF-MS/MS证明融合蛋白由SUMO蛋白和CXCLl蛋白组成,除去SUMO蛋白后的表达终产物经Westem blotting鉴定,与其相应的抗体有特异性结合,证明分离得到的小分子蛋白即为目的蛋白.结论:运用这一技术可将载体蛋白完全去除从而达到精确表达小分子蛋白的目的,在分子生物学的实验研究中有很好的应用前景.
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宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态的研究
背景与目的：抑癌基因Ras相关区域家族1A (Ras association domain family 1A，RASSF1A)启动子及第1外显子区CG位点高甲基化导致该基因沉默与多种恶性肿瘤的发生发展相关。本研究旨在探讨宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态以及甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine，5-Aza-dc)作用对RASSFIA基因表达的影响。方法：采用5μmol/L(低浓度)和10μmol/L(高浓度)的5-Aza-dc作用于HeLa、Caski、HT-3以及C-33A等4种宫颈癌细胞系，分别采用甲基化特异PCR (methylation-specific PCR，MSP)和亚硫酸盐基因组测序法(bisulfite genome sequencing，BGS)检测5-Aza-dc处理前后RASSF1A基因启动子及第1外显子区甲基化状态，RT-PCR检测干预前后RASSF1A基因mRNA的转录表达。结果：HeLa和Caski两种HPV阳性细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区均呈低甲基化状态，mRNA表达阳性。低浓度和高浓度5-Aza-dc作用后，mRNA表达未见明显改变(FHeLa=3.003，P=0.125；FCaski=0.045， P=0.956)。HT-3和C-33A两种HPV阴性宫颈癌细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区则表现为高度甲基化状态，mRNA表达受到抑制。低浓度和高浓度5-Aza-dc作用后，HT-3和C-33A细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区CG位点甲基化程度降低，检测到其mRNA表达，高浓度5-Aza-dc作用组表达水平明显高于低浓度组和细胞对照组(FHT-3=18.002，P=0.03；FC-33A=17.179，P=0.03)，LSD-t检验显示差异有统计学意义(P<0.05)。结论：HPV阳性和HPV阴性宫颈癌细胞系中RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态不同；RASSF1A基因启动子及第1外显子区的高甲基化可抑制该基因表达；5-Aza-dc处理可使RASSF1A基因启动子及第1外显子区去甲基化，重新激活基因的表达，这种作用在一定范围内有剂量依赖性。
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成人跖疣人乳头瘤病毒分型及与临床特征的关系
目的 检测成人跖疣乳头瘤病毒(HPV)型别,并探讨HPV分型与临床特征的关系.方法 采用PCR扩增、基因测序和TA克隆技术检测221例跖疣患者疣体的HPV型,记录患者的年龄、病程、症状和疣体数.结果 221例标本中,HPV阳性率为97％(215/221).单一HPV型占96％(206/215),HPV 27、2、57和7(Alpha属)分别占44.7％ (92/206)、12.1％(25/206)、7.3％(15/206)和0.5％(1/206);HPV 65(Gamma属)占0.5％(1/206);HPV 1、63(Mu属)占33.5％ (69/206)和1.5％ (3/206).HPV 27、2和57三型感染者之间年龄、病程、疣体个数、疼痛发生率和性别比较,差异均无统计学意义.与HPV 27感染者相比,HPV 1感染者与年龄≤30岁、病程≤1年、疣体数≤2个和疼痛高发生率相关.结论 HPV 27、2、57和1是感染成人跖疣患者的主要HPV型.HPV型与患者的临床特征间存在相关性.
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应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化
目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用.方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况.结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00％,在正常胰腺、癌旁及癌组 织中平均分别为1.79％、93.75％和100.00％,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P＜0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P＞0.05).在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达；PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89％,P＜0.05),mRNA表达无变化.结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默.该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点.
关键词： 胰腺癌 甲基化 Ras相关区域家族1A 重亚硫酸盐测序PCR TA克隆 -
肝细胞生长因子真核表达质粒的构建、鉴定及表达
目的 克隆人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)的编码基因,构建真核表达载体,获得hHGF蛋白.方法 从含hHGF的人肝脏组织总RNA中,利用RT-PCR方法扩增出hHGF cDNA;利用TA克隆技术,将该基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1+质粒,转化E.coli DH5α细胞,鉴定pcDNA3.1+-hHGF重组质粒.将重组质粒pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞,应用ELISA方法检测hHGF在293T细胞中的表达.结果 ①测序结果证实本实验克隆的基因与人HGF基因序列一致.②重组质粒pcDNA3.1+-hHGF是具有表达功能的真核表达质粒.③ pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞,于转染后12、24、48、72 h均能检测到hHGF表达.结论 成功构建hHGF真核表达载体,获得分泌性hHGF蛋白.
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天然高产脂肪酶细菌的分离鉴定及脂肪酶基因的分析
目的:从环境中分离高产脂肪酶的细菌,并克隆其脂肪酶基因.方法:从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌,鉴定菌种后,设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆,重组载体转入E.coli DH5α构建工程菌,双酶切及测序鉴定脂肪酶基因.结果:经过微生物菌种鉴定获得4株高活力菌,其中一株金葡菌产酶高,利用PCR技术成功扩增脂肪酶基因,该基因经过克隆测序及其双酶切鉴定证实为新发现的突变脂肪酶基因,其二级结构与标准基因(EU310372)有较大不同.结论:成功分离一株高产脂肪酶的菌株--金黄色葡萄球菌,克隆的脂肪酶基因为新发现的突变型.
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A组β-溶血性链球菌DNase B基因序列的克隆与序列分析
目的克隆A组β-溶血性链球菌(Group A Streptococcus, GAS)DNase B基因序列.方法根据genBank中登录的多种DNA酶B的序列,进行同源性分析,设计相对保守的针对DNase B基因的引物,以链球菌基因组为模板进行PCR扩增,目的片段经TA克隆至pMD18-T质粒后测定其核酸序列,然后进行序列的查询与比对.结果成功克隆出A组链球菌DNase B基因全长序列共810 bp,其中包括中128 bp的信号肽编码区和681 bp的成熟肽编码区,以及5'端非编码区的一个T.结论 A组β-溶血性链球菌DNase B基因序列的成功克隆,为对其深入研究打下坚实基础.
关键词： A组β-溶血性链球菌 脱氧核糖核酸酶B TA克隆 -
TA克隆的应用研究
目的:探讨用于PCR扩增产物快速高效的克隆技术.方法:为制备T载体,用SmaI消化质粒pUC18成纯末端,纯化后与Taq DNA聚合酶及dTTP,75℃反应2h,构建成加上T尾的线性pUC18载体.将由质粒pBR322-HPV16中PCR扩增获得早期蛋白E6的基因扩增产物,根据TA克隆策略克隆至pUC18-T载体中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子,并对TA克隆连接条件做了探讨.结果:获得重组质粒pUC18-E6.结论:TA克隆采用低温延时连接,阳性克隆率高,是高效、快速的PCR产物克隆.
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荧光定量RT-PCR法检测OATP-B和OATP-D mRNA表达
目的 建立荧光定量RT-PCR检测肺癌及正常肺组织中人类有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide,OATP)OATP-B、OATP-D mRNA表达的方法,了解肺癌和正常肺组织中OATP-B、OATP-D mRNA的表达水平.方法 利用RT-PCR方法从肺癌及正常肺组织中扩增出目的 基因片段,用TA克隆的方法将基因片段插入到PGEM-T质粒载体中,在Line-Gene荧光定量检测系统上建立检测OATP-B、OATP-D mRNA表达的标准曲线,并通过40例肺癌及正常肺组织标本进行验证.结果 成功构建了OATP基因的质粒重组子,建立了在mRNA水平定量检测OATP-B、OATP-D基因的标准曲线,相关系数为0.998.以荧光定量RT-PCR法检测,OATP-B、OATP-D的mRNA在肺癌及正常肺组织中均有表达,且肺癌中OATP-B、OATP-D mRNA的表达水平高于正常肺组织(P＜0.05).结论 成功建立了荧光定量RT-PCR检测OATP-B、OATP-D mRNA表达的方法,检测结果用绝对拷贝数表示,定量准确可靠,敏感性高.
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5-Aza对肝纤维化进程及miR-29b基因异常甲基化的影响
目的 观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza)对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞株活化状态及miR-29b基因甲基化的影响.方法 采用MTT、qRT-PCR及Western blot技术检测5-Aza治疗组细胞活化状态及miR-29b含量;BSP及TA克隆检测miR-29b启动子区CpG岛甲基化的改变.结果 相较TGF-β1组,5-Aza组细胞增殖率下调为58.62％ (P ＜0.05)且Ⅰ型胶原及α-SMA的mRNA及蛋白均显著下降(P＜0.05).miR-29b在5-Aza治疗后呈时间依赖性上升(P＜0.05).BSP及TA克隆显示5-Aza组miR-29b甲基化率为7.27％,呈现下调(P＜0.05).结论 5-Aza可负性调控肝纤维化进程,这与miR-29b启动子区去甲基化进程密切相关.
关键词： 肝纤维化 miR-29b 重亚硫酸盐测序PCR TA克隆 -
原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建
目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript Ⅱ SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析.结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank"AB087266"登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致.结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体.
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可调控CYP 4A1的逆转录病毒重组质粒的构建与鉴定
目的:运用分子生物学技术克隆CYP 4A1全长cDNA基因,进一步构建可由强力霉素诱导表达CYP4A1的逆转录病毒重组质粒.方法:运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从大鼠肝组织中扩增出CYP 4A1全长基因,克隆至pMD18-T载体,将构建正确的pMD18-CYP 4A1质粒采用双酶切亚克隆到逆转录病毒载体载体pRevTRE中,采用酶切反应、PCR鉴定和序列测定鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/CYP 4A1;在脂质体介导下分别将质粒pRevTRE/CYP 4A1与逆转录病毒四环素调节质粒pRevTet-on转染至包装细胞PT67,分别经抗性筛选获得稳定产生病毒的包装细胞系后收集转染后的细胞上清.用荧光定量PCR测定病毒滴度.结果:经酶切鉴定、PCR鉴定和序列测定证实成功构建了pRevTRE/CYP 4A1逆转录病毒重组质粒;转染pRevTet-on的PT67细胞病毒滴度为7.2×1010copies/L,转染pRevTRE/CYP 4A1的PT67细胞病毒滴度为5.46×109copies/L.结论:成功构建了含四环素调控CYP 4A1基因的逆转录病毒重组质粒,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为CYP 4A1基因功能及其相关疾病的研究打下实验基础.
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利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒
目的: 利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础. 方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT 全长cDNA.将扩增的CAT cDNA 与dATP 反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT.人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定.pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实. 结果: 获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为"AY028632"的CAT cDNA序列一致. 结论: pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白His tag-PEP -1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础.
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HRM法检测肿瘤细胞PTEN基因突变实验研究
目的:探索高分辨率熔解曲线(HRM)法检测肿瘤细胞系PTEN基因突变中的应用.方法:采用HRM法初筛肿瘤细胞系PTEN的突变,测序验证HRM筛选结果,TA克隆测序进一步明确突变情况.结果:HRM初筛出Jurkat细胞PTEN基因存在突变,测序结果与HRM结果一致,TA克隆测序确定Jurkat细胞系PTEN基因为缺失突变.结论:HRM法可准确筛选肿瘤细胞系中PTEN基因突变,适于肿瘤细胞PTEN基因突变筛选.
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胰岛素样生长因子结合蛋白7表达质粒的构建及其瞬时转染对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响
目的 采用TA克隆的方法构建IGFBP7表达载体,考察IGFBP7过表达对SMMC7721细胞生存活力的影响.方法 RT-PCR法调取IGFBP7表达基因,构建pMD19-T Simple-IGFP7载体,测序鉴定后与pIRES2-ZsGreen1质粒进行拼接构建表达质粒;随后表达质粒转染SMMC7721细胞,RTFQ-PCR测定SMMC7721细胞中IGFBP7 mRNA水平,MTT检测IGFBP7表达质粒转染对SMMC7721细胞增殖的影响.结果 IGFBP7 cDNA设计长度为840 bp,电泳结果可在750～1 000bp观察到清晰单一条带,表明成功调取IGFBP7基因;pMD19-TS-IGFBP7载体和pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7表达质粒测序结果正确,表明表达质粒构建成功;RTFQ-PCR结果显示IGFBP7转染组细胞IGFBP7 mRNA水平显著升高;MTT结果显示IGFBP7转染组细胞增殖明显下降.结论 成功用TA克隆的方法构建了IGFBP7表达载体,IGFBP7的过表达能显著抑制SMMC7721细胞增殖.
关键词： TA克隆 胰岛素样生长因子结合蛋白7 实时荧光定量PCR 增殖 -
大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒重组体构建
目的构建大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒介导的表达载体.方法提取大鼠脑组织总RNA,用逆转录PCR扩增DNA多聚酶β(POLB)的编码区,与T载体连接,作DNA测序后,酶切POLB基因并连入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.酶切鉴定,重组腺病毒质粒(pAd-polb)和Lipofectamine2000转染293细胞,用293细胞扩增重组腺病毒.结果8个TA克隆中有2个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLB cDNA序列完全一致.DNA序列正确的POLB重组腺病毒质粒Ad-polb转染293细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光.结论用TA克隆和AdEasy系统,成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体.
