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应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化
目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用.方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况.结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00％,在正常胰腺、癌旁及癌组 织中平均分别为1.79％、93.75％和100.00％,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P＜0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P＞0.05).在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达；PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89％,P＜0.05),mRNA表达无变化.结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默.该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点.
关键词： 胰腺癌 甲基化 Ras相关区域家族1A 重亚硫酸盐测序PCR TA克隆 -
5-Aza对肝纤维化进程及miR-29b基因异常甲基化的影响
目的 观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza)对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞株活化状态及miR-29b基因甲基化的影响.方法 采用MTT、qRT-PCR及Western blot技术检测5-Aza治疗组细胞活化状态及miR-29b含量;BSP及TA克隆检测miR-29b启动子区CpG岛甲基化的改变.结果 相较TGF-β1组,5-Aza组细胞增殖率下调为58.62％ (P ＜0.05)且Ⅰ型胶原及α-SMA的mRNA及蛋白均显著下降(P＜0.05).miR-29b在5-Aza治疗后呈时间依赖性上升(P＜0.05).BSP及TA克隆显示5-Aza组miR-29b甲基化率为7.27％,呈现下调(P＜0.05).结论 5-Aza可负性调控肝纤维化进程,这与miR-29b启动子区去甲基化进程密切相关.
关键词： 肝纤维化 miR-29b 重亚硫酸盐测序PCR TA克隆 -
EEN-B1及其启动子甲基化在外阴鳞状细胞癌中的表达及意义
目的:检测EEN-B1在外阴鳞癌组织及外阴鳞癌细胞株中的启动子甲基化及蛋白表达情况,探讨其启动子异常甲基化在外阴鳞癌发病过程中的作用.方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic se-quencing PCR,BSP)联合TA克隆测序法,以正常外阴组织作对照,检测外阴鳞癌组织中EEN-B1启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)作用于外阴鳞癌细胞A-431,检测作用前后甲基化率变化情况;Western blot方法检测外阴鳞癌及对照组织中EEN-B1蛋白表达情况,检测5-aza-dC处理前后A-431中该蛋白表达情况.结果:在癌组织中EEN-B1启动子的甲基化率为54.66％,与对照组织的12.16％相比,差异具有统计学意义;而在外阴鳞癌组织中EEN-B1蛋白明显下调;经1×10-7mol/L5-aza-dC处理72小时后,A-431细胞系中EEN-B1启动子的甲基化率由67.05％下降至26.82％(P ＜0.05),而该蛋白表达明显上调.结论:外阴鳞癌细胞株A-431及癌组织中EEN-B1基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化可能导致了外阴鳞癌组织及细胞系中EEN-B1基因的表达沉默.
关键词： 外阴鳞癌 甲基化 EEN-B1 重亚硫酸盐测序PCR TA克隆
