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PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化
目的构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,并进行PEP-1-SOD1融合蛋白表达和纯化.方法以pBluescript Ⅱ SK-SOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1 cDNA.经酶切后,分别构建原核表达载体pET15b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coli BL21(DE3),表达SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白,并进行鉴定.结果 SDS-PAGE和Western blot分析表明,分别在相对分子质量22 000和26 000处出现SOD1和PEP-1-SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在.结论已成功地制备出SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白.
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PEP－1－SODl融合蛋白的制备、表达及纯化
目的：构建原核表达载体pQE30－PEP－1－SOD1，并进行PEP－1－SOD1融合蛋白表达和纯化。方法载体质粒pQE－30及模板质粒pUC57－PEP－1－SOD1分别进行酶切后，构建原核表达载体pQE30－PEP－1－SOD1载体。经测序证实构建成功后，转化JM109，表达PEP－1－SOD1融合蛋白，并进行鉴定。结果 SDS－PAGE电泳分析表明，位于相对分子质量约25×103处出现PEP－1－SOD1的目标表达条带；目的蛋白以天然的可溶性的形式存在。结论已成功制备出PEP－1－SOD1融合蛋白。
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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及酶活性
目的 研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导人大鼠肝脏组织的能力及其酶活性.方法 实验分为SOD1组和PEP1-SOD1组,分别经尾静脉注射500 μg SODI和500 μg PEP-1-SOD1融合蛋白人大鼠体内,于0.5,1,2,4,8和24 h时间点取肝脏(n=6,每组,每个时间点).免疫荧光技术检测PEP-1-SOD1的转导能力.黄嘌呤氧化酶法测定肝脏组织SOD1活性.结果 SOD1蛋白不能进入肝脏组织内.PEP-1-SOD1可转导入肝脏组织内,SOD1活性于注射后0.5 h开始升高,1 h达高峰,持续存在达24 h,两组各个时间点比较,差异有统计学意义(P＜0.01).SOD1组内各时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PEP-1-SOD1以天然酶活性形式转导入肝脏组织,为进一步的动物模型实验及临床疾病进行蛋白质治疗提供理论基础.
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原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建
目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒.方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript Ⅱ SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析.结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank"AB087266"登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致.结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体.
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PEP-1肽介导人Cu,Zn-SOD转导入大鼠离体缺血再灌注损伤心脏
目的:构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,观察PEP-1-SOD1融合蛋白在大鼠离体缺血再灌注损伤心肌组织内的转导能力和转导的目的蛋白是否具有酶活性.方法:构建原核表达载体pET15 b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白.采用Langendorff灌流系统,大鼠离体心脏停灌30 min后复灌60 min建立缺血再灌注损伤模型.实验分为对照组,SOD1组,25,50,100 μmol/L PEP-1-SOD1组.免疫荧光检测PEP-1-SOD1的转导效果, SOD试剂盒检测酶活性.结果:在荧光显微镜下,PEP-1-SOD1融合蛋白预处理组心肌组织中可见特异性的绿色荧光位于心肌细胞胞质内,25 ,50,100 μmol/L组阳性率分别为32.6%,42.5%,60.9%.SOD1蛋白预处理组和对照组未见到绿色荧光.与对照组相比,PEP-1-SOD1各组SOD酶活性均显著增加(P＜0.01),且SOD酶活性与PEP-1-SOD1浓度呈正相关, SOD1组与对照组之间无显著性差异(P＞0.05).结论:PEP-1-SOD1融合蛋白以天然有活性的形式穿透进入大鼠离体缺血再灌注损伤的心肌细胞,且具有剂量依赖性.转导入细胞内的PEP-1-SOD1蛋白具有酶活性.本研究为SOD1治疗由氧化应激所导致的各种疾病提供了一种有效的递送途径.
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PEP-1-SOD1融合蛋白转导入小鼠海马组织的能力及时间关系
目的:研究PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD1)转导入小鼠海马组织的能力及时间关系.方法:健康雄性昆明小鼠随机分为SOD1组及PEP-1-SOD1组,分别经腹腔注射SOD1蛋白及PEP-1-SOD1融合蛋白200μg,于注射后1,2,4,8,24 h等5个时间点分别取小鼠海马组织进行检测(n=5).Western Blot测定PEP-1-SOD1蛋白的表达;免疫荧光组织化学方法测定PEP-1-SOD1在海马组织的分布;黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后1 h,小鼠海马组织在Mr约26×103处出现目的蛋白条带,4 h达高峰,24 h仍有蛋白转导;SOD1组未发现目的蛋白.免疫荧光检测发现PEP-1-SOD1组海马组织中出现特异性绿色荧光;SOD1组未发现绿色荧光.PEP-1-SOD1组酶活性于注射后1 h升高至(61.7±2.9)×103U/g,4 h达峰值(82.6±4.2)×103U/g,之后开始下降,24 h仍明显高于SOD1处理组(P<0.01);SOD1组酶活性各时间点相比较差异无统计学意义.结论:PEP-1可以介导SOD1以天然活性形式转导进入小鼠海马组织,4 h达高峰,并保持活性至少达24 h.
