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人肝细胞生长因子α原核表达体系的构建及表达
人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)由α和β链组成,为进一步研究hHGFα的生物学功能,我们采用转录前加工修饰方法,构建了hHGFα原核表达体系.
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hHGF转染HepG2细胞后基因表达谱差异筛选
目的:构建hHGF真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,筛选其对HepG2细胞的差异表达基因.方法:构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定:转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:运用基因表达谱芯片技术,筛选pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,经表达谱芯片分析差异表达基因.结果:构建的表达载体经酶切和测序确定;转染HepG2细胞后hHGF表达经蛋白免疫印迹证实;经20000个基因的表达谱芯片分析发现,其中有430个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:筛选出HGF转染HepG2细胞后的差异表达基因,对其在肝细胞中多种作用机制研究提供了重要依据.
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hHGF基因肾脏电转染对大鼠慢性移植肾病的影响
目的:使用肾脏直接基因电转染方法对大鼠移植肾进行hHGF基因转染,观察该基因对防治大鼠慢性移植肾病的作用.方法:雄性SD大鼠20只,随机分为治疗组和对照组,每组10只.利用移植肾离体灌流时机将含有hHGF基因的质粒(治疗组)及空质粒(对照组)用电转染方法转入大鼠肾脏,并行自体肾移植及对侧单肾切除.于移植第8天及12周后观察hHGF基因在肾组织中的表达,并对移植肾进行功能和组织学评价.结果:治疗组肾组织hHGF基因表达于移植后第8天为阳性,对照组及治疗组移植后12周hHGF基因表达阴性,治疗组血浆hHGF水平在电转染后第7天为(76.9±11.7)pg/ml,第12周的hHGF浓度为0,而对照组第7天及第12周均未测到hHGF.治疗组血肌酐、尿素氮水平于移植后12周显著低于对照组.组织学评价显示,于肾移植后12周,治疗组肾间质纤维化程度显著轻于对照组.结论:hHGF基因转染治疗对减轻移植肾的肾功能损伤和肾间质的纤维化具有远期效果,这种远期效果可能与hHGF基因对移植肾早期缺血再灌注损伤的保护作用及抗纤维化作用有关.因此,本组认为hHGF基因转染在肾移植初期的治疗作用对预防慢性移植肾病的发生和发展起了重要的作用.
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人肝细胞生长因子基因真核表达质粒的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建人肝细胞生长因子(Human hepatocyte growth factor,hHGF)真核表达质粒,并检测其在人骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中的表达及其对细胞生长的影响.方法 采用密度梯度法从人骨髓中分离BMSCs,流式细胞术检测细胞表型,成脂及成骨诱导其分化.PCR扩增hHGF基因,定向克隆至pEGFP-N1载体中,构建重组表达质粒pEGFP-N 1-hHGF,通过电穿孔法转染BMSCs,荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR及Western blot法检测hHGF基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTT法检测hHGF对BMSCs增殖活力的影响.结果 BMSCs高表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45；BMSCs在体外有向成脂及成骨细胞诱导分化的能力.酶切及基因测序证实,重组表达质粒pEGFP-N 1-hHGF构建正确；转染后48 h观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达；RT-PCR法和Western blot检测到hHGF基因在BMSCs中表达；转染hHGF基因的BMSCs增殖活力明显高于空白对照组和空载体转染组(P＜0.05).结论 成功构建了hHGF基因真核表达质粒,转染人BMSCs后获得表达,表达的hHGF可促进BMSCs增殖.
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表达人肝细胞生长因子突变体--NK4工程菌的发酵工艺研究
目的建立重组NK4融合基因工程菌的发酵工艺.方法采用锥形瓶、发酵罐发酵,对工程菌生长和表达条件如pH、诱导时间及诱导剂浓度等方面进行优化.确定其佳诱导表达条件,在15 L自控发酵罐中进行分批补料培养.结果在15 L发酵罐进行工程菌发酵,菌体收获量湿重可达24.6g/L±0.98g/L,目的蛋白的表达量保持在菌体总蛋白的50%左右,发酵时间为11 h.结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.
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人肝细胞生长因子重组腺病毒的构建及其对人胎肝细胞细胞周期的影响
目的利用AdEasy系统构建人肝细胞生长因子(HGF)复制缺陷型重组腺病毒(AdHGF),并观察其对人胎肝细胞细胞周期的影响.方法将质粒pUCHGF扩增、酶切获得人HGF cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-HGF,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAdHGF,经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdHGF;将AdHGF体外感染人胎肝细胞,以RT-PCR检测HGF在胎肝细胞的表达;同时通过流式细胞仪测定AdHGF对胎肝细胞细胞周期的作用.结果连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdHGF;经293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化终获得约4×1010efu/ml滴度的重组病毒;AdHGF体外感染人胎肝细胞3d后,HGF表达明显增加,流式细胞仪检测结果显示感染后的胎肝细胞由G0/G1期向S期和G2/M期转化.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和HGF的重组腺病毒Ad-HGF;AdHGF体外感染胎肝细胞可显著提高HGF的表达并促进肝细胞增殖,这将为肝细胞移植和基因治疗肝纤维化提供新的手段.
关键词： 人肝细胞生长因子 复制缺陷型重组腺病毒 基因治疗 肝细胞移植 -
肝细胞生长因子真核表达质粒的构建、鉴定及表达
目的 克隆人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)的编码基因,构建真核表达载体,获得hHGF蛋白.方法 从含hHGF的人肝脏组织总RNA中,利用RT-PCR方法扩增出hHGF cDNA;利用TA克隆技术,将该基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1+质粒,转化E.coli DH5α细胞,鉴定pcDNA3.1+-hHGF重组质粒.将重组质粒pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞,应用ELISA方法检测hHGF在293T细胞中的表达.结果 ①测序结果证实本实验克隆的基因与人HGF基因序列一致.②重组质粒pcDNA3.1+-hHGF是具有表达功能的真核表达质粒.③ pcDNA3.1+-hHGF转染293T细胞,于转染后12、24、48、72 h均能检测到hHGF表达.结论 成功构建hHGF真核表达载体,获得分泌性hHGF蛋白.
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人肝细胞生长因子基因重组慢病毒载体的构建及其在成肌干细胞中的表达
目的：构建人肝细胞生长因子（human hepatocyte growth factor ，hHGF）基因重组pCMV －G﹠NR－U6－hHGF慢病毒载体，并检测其在成肌干细胞系C2C12细胞中的hHGF表达，为治疗失神经喉肌纤维化的研究提供依据。方法采用RT －PCR法扩增并纯化得到hHGF基因片段，并将其克隆到 pCM V －G﹠ NR －U6上，再将重组慢病毒载体转化入感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌落并行BamHI和 HindⅢ双酶切鉴定。对筛选后的重组质粒阳性克隆行PCR鉴定和测序，将表达质粒与包装质粒共转染293T细胞包装hHGF慢病毒，荧光显微镜检测病毒滴度，再进一步转染C2C12细胞（分为空白对照组、空载体组、HGF重组慢病毒过表达组），后行PCR和WB检测HGF的表达情况。结果 PCR鉴定和测序结果显示所构建的慢病毒载体正确无误，包装后的病毒滴度＞1×109 IU／mL ；慢病毒过表达组的 HGF表达量均较空白对照组、空载体组明显增高，而且72 h仍有稳定的表达。结论本实验成功构建了慢病毒载体pCMV －G﹠NR－U6－hHGF ，并能够在离体培养的成肌干细胞系C2C12细胞中稳定高效表达 HGF ，为治疗失神经喉肌等骨骼肌纤维化、提高神经修复效果的实验研究提供了依据。
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人肝细胞生长因子基因肌肉电转染对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用
目的:探讨人肝细胞生长因子(hHGF)基因肌肉电转染对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用.方法:♂SD大鼠20只,随机分为2组,即研究组和对照组,每组10只.研究组大鼠接受hHGF肌肉电转染,在热缺血前3 d将含有hHGF基因的质粒用电转染技术转入大鼠双侧胫前肌肉内,3 d后建立大鼠肾热缺血模型,测定hHGF的血药浓度,并对缺血再灌注肾脏进行功能和组织学评价.结果:研究组肾组织及血浆hHGF基因表达水平显著高于对照组.研究组血肌酐水平较对照组低.组织学评价结果显示,研究组肾小管细胞凋亡评分显著低于对照组.研究组淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润均较对照组少.结论:本研究结果表明hHGF基因肌肉电转染对大鼠肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用,并提示肌肉hHGF基因电转染有可能成为防治移植肾缺血再灌注损伤的安全有效的方法之一.
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IL-10-HGF融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用
目的 探讨人白介素-10(IL-10)与人肝细胞生长因子(HGF)融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用.方法 采用PCR方法,分别构建pcDNA3.1-flag-IL-10、pcDNA3.1-flag-HGF与pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF真核表达载体,瞬时转染肝星状细胞LX-2;利用RT-PCR和Western blot检测LX-2细胞中IL-10、HGF的表达;选用MTT法检测转染24、48和72 h 后LX-2细胞的增殖情况.结果 成功构建了IL-10-HGF融合基因真核表达载体pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF.与pcDNA3.1-flag-IL-10和pcDNA3.1-flag-HGF组比较,pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF融合组48 h和72 h LX-2细胞数减少(n=3,P＜0.05).结论 IL-10-HGF融合基因可有效抑制肝星状细胞LX-2的增殖.
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四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体.方法 运用基因重组技术,将人HGF cDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluⅠ和SalⅠ之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定.结果 重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确.结论 本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略.
关键词： 人肝细胞生长因子 四环素诱导性真核表达载体 基因治疗 -
HGF与CTLA-4Ig双基因修饰增强脐带间充质干细胞的免疫抑制和促增殖作用
[目的]探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)经肝细胞生长因子(HGF)和细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)双基因修饰后免疫调节能力的变化及其促进肝细胞增殖作用的影响.[方法]酶联合消化法提取并鉴定人脐带间充质干细胞;对照组的hUCMSC转染携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad5-EGFP,实验组的hUCMSC转染携带HGF和CTLA-Ig双基因的腺病毒Ad5-HGF/CTLA-4Ig.流式细胞仪检测对照组hUCMSC转染Ad5-EGFP后72 h表达EGFP细胞比率;实验组Ad5-HGF/CTLA-4Ig转染hUCMSC 72 h后,CCK8检测细胞存活率,同时再次检测hUCMSC免疫表型和向成骨细胞分化的能力,ELISA检测细胞上清中HGF含量,Westem blot检测细胞中CTLA4-Ig蛋白的表达水平,通过CCK8法检测双基因修饰后hUCMSC对淋巴细胞增殖的影响及其上清对L02细胞增殖的影响.[结果]携带外源基因的腺病毒可有效转染hUCMSC,不影响其干细胞特性和多向分化能力,经HGF/CTLA-4Ig基因修饰hUCMSC可分泌高浓度HGF并高表达CTLA-4Ig,同时能有效地抑制淋巴细胞增殖,其上清能明显促进肝细胞增殖.[结论]hUCMSC经HGF/CTLA-4Ig基因修饰后生物学特性无明显改变,并能高表达HGF和CTLA-4Ig,其免疫调节及促进肝细胞增殖的能力进一步加强,为肝移植术后存在的肝细胞损伤的保护治疗提供了新思路.
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hHGF基因肾脏电转染对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用
目的: 使用肾脏直接基因电转染方法对大鼠肾脏进行hHGF基因转染,观察该基因转染对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用. 方法: 雄性SD大鼠20只,随机分为转染组和对照组,每组10只. 在热缺血前3 d将含有hHGF基因的质粒用电转染方法转入大鼠肾脏,3 d后建立大鼠肾热缺血模型,观察hHGF的药代动力学,并对缺血肾脏进行功能和组织学评价. 结果: hHGF基因电转染组肾组织及血浆hHGF基因表达水平高于对照组(P＜0.01). 转染组血肌酐水平低于对照组(P＜0.01),肾功能恢复快于对照组. 组织学评价显示,转染组肾小管细胞凋亡评分低于对照组(P＜0.05). 转染组淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润均较对照组少. 结论: 肾脏hHGF基因电转染组hHGF药代动力学和治疗效果均显示,该基因电转染对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用.
