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pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化
目的 构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础.方法 设计并合成两端分别带Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA.将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3'末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中得到pGEM-T-CAT.人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1.pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal Ⅰ-Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ-BamH I双酶切,利用同尾酶(Sal Ⅰ与Xho Ⅰ,Bgl Ⅱ与BamH I)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实.将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达.然后利用重组蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化.结果 测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为"AY028632"的CAT cDNA序列一致.SDS-PAGE和Western blot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15 U/g.结论 成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础.
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BAALC转录本1-6-8逆转录病毒表达载体的构建
目的 构建含BAALC(brain and acute leukemia, cytoplasmic)1-6-8转录本的逆转录病毒表达载体.方法 从KASUMI-1细胞株中提取mRNA,应用RT-PCR技术扩增BAALC 1-6-8获得目的 基因,选用pMDTM18-T Vector做TA克隆.分别双酶切TA克隆获得的阳性质粒和pcDNATM3.1/myc-His A+质粒,琼脂糖电泳纯化回收前者的小片段和后者的大片段,应用T4连接酶连接后转化至E.coli DH5α中.PCR扩增BAALC-myc-His基因序列,双酶切PCR产物和pLXSN载体,T4连接酶连接后转化至E.coli DH5α中,挑选阳性克隆,PCR、双酶切及测序鉴定.结果 PCR分别扩增TA克隆产物和重组pcDNATM3.1/myc-His A+-BAALC,在535 bp处均可见一清晰的特异性扩增条带,显示TA克隆及重组真核表达载体成功;PCR扩增pLXSN-BAALC-His大小为664 bp,双酶切及测序结果证实目的 基因片段正确插入到逆转录病毒表达载体pLXSN中.结论 分离得到了BAALC 1-6-8转录本基因,并成功构建了pLXSN-BAALC-His表达载体.
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p21Ha-ras原核表达载体的构建、表达及纯化的研究
目的:构建PET-28a(+)-Ha-ras原核表达质粒,并表达、纯化得到p21ras蛋白,为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础.方法:培养人肝癌细胞株7703,提取总RNA,通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA,然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras,重组质粒PMD-18T vector-Ha-ras经过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA,将PET-28a(+)同样经过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段,将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a(+)定向连接,构建出重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras,经酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实.将鉴定正确的PET-28a(+)-Ha-ras转入感受态BL-21(DE3)中诱导表达,利用组氨酸"标签"(His-Tag)对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化.结果:测序分析证实,克隆入PET-28a(+)的Ha-ras序列与Genbank登录号为"NM_005343"的Ha-ras cDNA序列一致,将重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras转化BL21(DE3).用IPTG诱导目的蛋白表达.SDS-PAG和蛋白纯化结果表明,PET-28a(+)-Ha-Ras在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白.结论:成功构建了原核表达载体PET-28a(+)-Ha-ras,并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白,从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础.
关键词： 原癌基因蛋白质p21(ras) TA克隆 原核表达 亲合纯化 -
乙型肝炎病毒基因组全序列的扩增及高效克隆
我们使用一步法扩增得到乙型肝炎病毒(HBV)基因组全序列,与T载体连接,并转化入自制的超高效TOPO 10感受态细胞,获得了较高的转化效率.为今后深入进行HBV全基因组的研究提供了基础和工具.
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SEO型汉坦病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆、表达
目的:开发简单、可靠的HTN、SEO型汉坦病毒血清学分型检测方法.方法:应用RT-PCR法对全NP蛋白基因及其型特异区基因进行扩增,经TA克隆及Cui-SS、Cui-155杆状病毒载体的构件、转获重组杆状病毒,再感染Sf9细胞进行表达.结果:克隆与表达了SEO病毒NP蛋白的全蛋白编码区及型特异编码区(155到429氨基酸处的编码基因).全NP蛋白表达产物与病毒株感染Vero E6细胞的反应谱完全一致,型特异区表达产物与相应的型特异McAb结合.结论:建立了SEO型病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆和表达方法,为开发简便、可靠的SEO型血清学分型检验方法奠定了基础.
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凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达
目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定；回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.
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果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体cDNA克隆及其载体的构建
目的克隆果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR-1)全长基因序列,构建其真核表达载体pdFR1.方法采用PCR方法扩增果蝇FGFR-1基因全长序列,克隆入载体pT-Adv, 转化大肠杆菌XL1-Blue,挑选白色菌落行酶切鉴定及测序.重组质粒pT-Adv/FGFR-1酶切,回收目的基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中, 命名为pdFR1,挑选白色菌落行酶切鉴定. 结果 pT-Adv/FGFR-1测序结果与GenBank完全一致, pdFR1行限制性内切酶酶切,酶切片段与预期值相符. 结论克隆了果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体全长基因序列,构建了其真核表达载体pdFR1,为完善异种分子疫苗免疫理论奠定基础.
关键词： 成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体 TA克隆 真核表达载体 -
重组质粒pGEM-HERV-K gag的构建与鉴定
目的:构建pGEM-HERV-K gag重组质粒.方法:分离人外周血单核细胞,提取总RNA,逆转录得到cDNA,PCR扩增目的基因后回收并纯化目的基因,TA基因克隆方法构建重组质粒,并采用酶切和PCR进行鉴定.结果:以PBMC的cD-NA为模板,PCR扩增获得446 bp的HERV-K gag目的基因,克隆到pGEM-T载体构建pGEM-HERV-K gag重组质粒,酶切及PCR结果证实重组质粒构建成功.结论:成功构建pGEM-HERV-K gag质粒,此方法可用于比较病人与健康人的gag基因的序列.
关键词： HERV-K gag基因 TA克隆 外周血单核细胞 -
EEN-B1及其启动子甲基化在外阴鳞状细胞癌中的表达及意义
目的:检测EEN-B1在外阴鳞癌组织及外阴鳞癌细胞株中的启动子甲基化及蛋白表达情况,探讨其启动子异常甲基化在外阴鳞癌发病过程中的作用.方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic se-quencing PCR,BSP)联合TA克隆测序法,以正常外阴组织作对照,检测外阴鳞癌组织中EEN-B1启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)作用于外阴鳞癌细胞A-431,检测作用前后甲基化率变化情况;Western blot方法检测外阴鳞癌及对照组织中EEN-B1蛋白表达情况,检测5-aza-dC处理前后A-431中该蛋白表达情况.结果:在癌组织中EEN-B1启动子的甲基化率为54.66％,与对照组织的12.16％相比,差异具有统计学意义;而在外阴鳞癌组织中EEN-B1蛋白明显下调;经1×10-7mol/L5-aza-dC处理72小时后,A-431细胞系中EEN-B1启动子的甲基化率由67.05％下降至26.82％(P ＜0.05),而该蛋白表达明显上调.结论:外阴鳞癌细胞株A-431及癌组织中EEN-B1基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化可能导致了外阴鳞癌组织及细胞系中EEN-B1基因的表达沉默.
关键词： 外阴鳞癌 甲基化 EEN-B1 重亚硫酸盐测序PCR TA克隆
