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草酸和草酸钙结晶损伤肾小管上皮细胞的差异蛋白质组学研究
目的 分析并鉴定草酸和一水草酸钙(COM)结晶损伤人肾小管上皮细胞(HK-2)后细胞蛋白质谱的表达变化,探讨肾小管上皮细胞受损在肾结石形成中的可能作用.方法 体外培养正常HK-2细胞至90%融合后,换无血清培养基,随机分为2组.实验组培养基内加入2 mmol/L草酸+200 mg/L COM结晶,37 ℃孵育.分别抽提2组细胞的总蛋白,双向凝胶电泳结合液相色谱-电喷雾离子阱质谱(LC-ESI-MS/MS)技术对2组中差异表达的蛋白质进行分离和鉴定.蛋白印迹法对鉴定出的蛋白进行验证.结果 成功建立细胞总蛋白的双向凝胶电泳图谱,经软件分析和质谱鉴定出差异蛋白质12个:FK506结合蛋白4、α-烯醇酶、M2型丙酮酸激酶、ATP合成酶α亚单位、3′,5′-二磷酸核苷酸酶1、核磷蛋白2、L-乳酸脱氢酶B、芽胞发芽蛋白3、Cofilin-1、Fascin、40S核糖体蛋白S17和胞液氨基肽酶1.差异蛋白涉及细胞能量代谢、细胞增殖、凋亡、钙离子通道活性调控、细胞运动及信号转导等多种生理活动.蛋白印迹法检测示HK-2细胞损伤后ENO1蛋白表达上调,而Cofilin-1表达下调,证实双向凝胶电泳和质谱分析可靠.结论 高浓度草酸和COM结晶可使正常人HK-2细胞蛋白表达发生改变,这些差异表达蛋白既可起到细胞的自我保护作用,又可能通过相应途径在肾结石的形成中起重要作用.
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牛磺酸对草酸和草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用
目的 探讨牛磺酸在体外细胞培养中对草酸和草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用及机制.方法 将体外培养的人远端肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为5组:第1组,单纯HK-2细胞;第2组,HK-2细胞中加入草酸和一水草酸钙(COM);第3组,HK-2细胞中加入草酸、COM和牛磺酸;第4组,HK-2细胞中加入草酸、COM和夹竹桃麻素;第5组,HK-2细胞中加入草酸、COM和过氧化氢酶.培养6h后收集各组细胞上清液检测乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢(H2O2)、8-异前列腺素(8-IP)含量及单核细胞趋化蛋白质-1(MCP-1)蛋白水平,RT-PCR法检测细胞内MCP-1 mRNA、P47 phox mRNA表达水平;MTT法测定培养24 h后的细胞存活率.结果 培养24 h后MTT法检测第1组细胞的吸光度A值为0.996±0.044,第2组为0.626±0.011,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).培养6h后第1组细胞上清液H2O2、8-IP、LDH含量分别为(18.68±0.70) mmol/L、(12.72±1.69) ng/ml、(194.05±7.91) U/L,第2组分别为(53.27±1.88) mmol/L、(57.53±3.11)ng/ml、(484.34±29.44) U/L,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第1组MCP-1蛋白水平为(17.32±2.32) pg/ml,第2组为(69.21±3.39) pg/ml,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).第1组与第2组细胞的MCP-1 mRNA、P47phox mRNA表达水平倍增比值分别为1/3.51和1/1.38,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).MTT法检测第3、4、5组细胞的吸光度A值分别为0.748±0.033、0.825±0.078、0.815 ±0.037,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、4、5组细胞上清液H2O2、8-IP、LDH含量均明显少于第2组.第3、4、5组细胞上清液MCP-1蛋白水平分别为(60.13±1.83)、(28.53±1.41)、(56.44±1.13) pg/ml,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、4、5组细胞MCP-1 mRNA表达水平相对第1组的倍增比值分别为1/2.55、1/1.58、1/2.37,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、5组细胞P47phox mRNA表达水平相对第1组的倍增比值分别为1/1.25、1/1.35,与第2组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);第4组的倍增比值为1/0.61,与第2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 草酸、COM可诱导HK-2细胞氧化应激损伤,细胞的P47phox mRNA和MCP-1 mRNA表达增加.牛磺酸可以减轻细胞的损伤,但机制可能不是通过抑制P47 phox表达的途径进行.
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草酸和一水草酸钙结晶对人肾小管上皮细胞的影响
目的 观察草酸和一水草酸钙结晶对体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)的毒性作用和蛋白表达的影响,探讨上皮细胞受损在肾结石形成过程中的可能作用.方法 体外培养正常人HK-2细胞至长满后,换成无血清培养基,加入草酸至不同终浓度,显微镜下观察结晶的形成及其对细胞的粘附.收集结晶以傅立叶红外光谱仪(FT-IR)分析其成分.CCK-8试剂盒检测1、2、5和10mmol/L草酸分别作用4、12和24 h后对HK-2细胞的毒性反应,Bradford法检测HK-2细胞表达总蛋白量的变化.结果草酸加入含Ca2+的DMEM培养基后,数分钟内显微镜F即可见结晶形成并粘附于细胞表面.FT-IR分析表明结晶成分为一水草酸钙.草酸和一水草酸钙对HK-2的毒性作用呈明显浓度依赖性,但在1～10 mmol/L草酸浓度下毒性作用不随时间延长而增加.1、2、5mmol/L草酸作用12 h和对照组HK-2表达蛋白量分别为(358±51)、(365±43)、(328±52)和(329±60)mg/L,P值均＞0.05,而10 mmol/L草酸作用12 h后,HK-2表达蛋白量为(264±76)mg/L,显著低于对照组(P＜0.05).结论 草酸和一水草酸钙可对正常人HK-2细胞产生毒性损伤,造成细胞表达蛋白的改变,可能在肾结石的形成中起重要作用.
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草酸钙晶体刺激下人巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的表达
背景：研究发现在肾结石模型中肾间质晶体周围存在大量单核/巨噬细胞浸润，显示巨噬细胞可能参与晶体在肾脏中的沉积过程，而巨噬细胞是人体重要的固有免疫细胞，在肾脏中沉积的大量的单核/巨噬细胞吞噬晶体，会产生一些炎症因子损伤和破坏肾小管上皮细胞，终有利于结石的形成。目的：探讨一水草酸钙晶体刺激人巨噬细胞后高迁移率族蛋白B1的表达水平。方法：用100 mg/L的一水草酸钙刺激巨噬细胞，分别于刺激后0，6，12，24和36 h，用Western blot检测细胞总蛋白和细胞浆内高迁移率族蛋白B1的含量；用实时荧光定量PCR，检测细胞中高迁移率族蛋白B1 mRNA表达情况；分别于一水草酸钙刺激后0，1，2和4 h，用酶联免疫吸附实验测定细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的水平。结果与结论：一水草酸钙刺激后0-6 h细胞浆内高迁移率族蛋白B1的含量较低，刺激后12-36 h细胞浆内高迁移率族蛋白B1逐渐增加。一水草酸钙刺激后0-6 h，巨噬细胞总蛋白中高迁移率族蛋白B1含量不高，在刺激后12 h细胞总蛋白高迁移率族蛋白B1的含量开始增加，并且在刺激后24-36 h保持在较高水平。RT-PCR结果显示，一水草酸钙刺激后0-12 h，培养细胞中高迁移率族蛋白B1的mRNA表达量无明显变化，刺激后18-24 h培养细胞中高迁移率族蛋白B1的mRNA表达量明显增加。ELISA结果显示，一水草酸钙刺激后2 h，细胞培养液上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达和释放增加，4 h达到明显高峰。结果表明，一水草酸钙可以诱导人巨噬细胞高迁移率族蛋白B1的表达及mRNA表达增加；诱导人巨噬细胞内肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达增加，且高迁移率族蛋白B1表达的时间明显晚于肿瘤坏死因子a和白细胞介素6的释放时间。
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槲叶中化学成分抑制一水草酸钙结晶作用的研究
尿路结石是一种常见病,在我国的贵州、广东等地发病率较高.尿路结石的成分主要为一水草酸钙、二水草酸钙、磷灰石类、磷酸镁铵、尿酸及尿酸盐类、嘌呤类、胱氨酸结石和软结石等.其中,一水草酸钙出现机会多,为防治尿路结石的重点研究对象.在正常人的尿液中,钙离子和草酸根离子的离子积大约是草酸钙溶度积的170倍.这样的过饱和溶液不析出晶体是由于正常人的尿液中存在着结晶抑制剂,而尿路结石病人的尿液中缺少结晶抑制剂,就导致结石的形成.
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一水草酸钙晶体对肾小管上皮细胞毒性作用的体外研究
目的:研究一水草酸钙(COM)晶体对肾小管上皮细胞的毒性作用.方法:以永生化的肾小管上皮HK-2细胞作为研究对象,用不同浓度的COM处理细胞,再以DAPI染色并细胞计数研究COM对HK-2细胞增殖的作用;检测细胞培养上清中的LDH含量,说明COM对HK-2的毒性;应用MTS法绘制HK-2细胞增殖曲线;使用流式细胞术检测COM对HK-2细胞的凋亡和坏死的作用.结果:DAPI染色后并细胞计数后HK-2细胞增殖能力经0.1 mmol/L的COM处理后便受到抑制,并与对照组比较,差异有显著统计学意义,并随COM浓度的升高,抑制作用更加显著.1 mmol/L的COM可使HK-2上清中的LDH显著升高,并在5 mmol/L更加明显.1 mmol/L的COM处理HK-2细胞后,细胞增殖曲线显著低于对照组,5 mmol/L的COM在处理HK-2细胞的第6天几乎全部死亡.0.1 mmol/L的COM可使HK-2细胞凋亡显著增加,1 mmol/L的COM可使HK 2细胞坏死显著增加,并随浓度的升高而增加.结论:0.1 mmol/L的COM刺激HK-2细胞即可使细胞出现生长抑制,浓度达到1 mmol/L后,则可出现细胞死亡.
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一水草酸钙晶体介导巨噬细胞炎症反应的体外研究
目的：研究一水草酸钙晶体（calcium oxalate monohydrate ，COM ）引起的不同表型巨噬细胞的炎症反应。方法在大鼠草酸钙结石模型中研究肾脏巨噬细胞的浸润情况，明确是否存在肾脏炎症。体外分离培养小鼠骨髓源巨噬细胞，流式细胞仪鉴定其细胞表面标志。将巨噬细胞体外分化为 M1和 M2，Real‐time PCR鉴定细胞标志。Real‐time PCR检测COM及损伤标志分子ATP对巨噬细胞IL‐1β表达的影响，ELISA法检测其IL‐1β的分泌。结果在大鼠草酸钙结石模型肾脏切片中，可见大量巨噬细胞浸润，显著多于对照大鼠。体外分离小鼠巨噬细胞，流式细胞仪鉴定表面标志符合巨噬细胞表型，Real‐time PCR鉴定 M1和 M2的标志也符合其相应表型。M1高表达 IL‐1β、CCL2，低表达MR、ARG ；M2高表达MR、ARG ，低表达IL‐1β、CCL2。COM及其损伤分子ATP均可使M1高表达IL‐1β。结论在草酸钙大鼠模型中，巨噬细胞浸润明显，COM和ATP可加重巨噬细胞炎症，并可加重M1的促炎症作用。
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二磷酸盐对一水草酸钙晶体体外生长与聚集的影响
应用Blomen建立的体外一水草酸钙结晶动力学研究方法,研究了新近合成的二磷酸盐PPD和PPC对一水草酸钙晶体生长与聚集的影响.实验结果表明:低浓度PPD、PPC (≤10 μmol/L)对草酸钙晶体生长的抑制程度分别为95.4%和6 8.6%,显著高于EHDP(51.7%)和PPI(21.6%) (P<0.01),并具有抑制一水草酸钙晶体聚集的作用(Tmi/Tmc>1),而EHDP促进晶体聚集(Tmi/Tmc＜1).据此推测:PPD、PPC有可能成为一类更有效防治结石复发的药物.
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三水草酸钙研究进展及其对泌尿系结石防治的理论意义
草酸钙(CaOxa)是尿石的主要成分,有3种水合物:一水草酸钙(COM)、二水草酸钙(COD)和三水草酸钙(COT),其中热力学稳定的COM在尿石和尿液中为普遍,COD次之.热力学不稳定的COT既不是尿石的主要成分,也很少在尿液中存在[1],但是能在实验室中制备出来.COT初被发现是伴随着COD从新鲜尿样中结晶,但COT在尿石中的作用仍欠清楚.有证据表明它可能是COM和COD形成的前驱体[2],也有报道COT对某些类型的尿石形成起重要作用.
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尿酸结石的新研究进展
尿酸结石包括纯尿酸结石、部分含钙的尿酸结石和含尿酸的混合型结石.含钙的尿酸结石中,常以一水草酸钙(COM)为结晶核或COM散布于结石周围的尿酸结石.
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枸橼酸减轻草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞损伤作用的实验研究
目的通过研究枸橼酸能否减轻一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate,COM)晶体对体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞造成的损伤,以探讨枸橼酸在尿路结石防治中的作用及其机制.方法分离、培养正常雄性Wistar大鼠的肾小管上皮细胞,在原代培养第5天时,将细胞分成3组(空白对照组、COM组及枸橼酸组),分别于各组培养液中培养2 h后用比色法测定各组细胞培养基中丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量及细胞的钙镁ATP酶(Ca2+-Mg2+-ATPase)和钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)的活性.结果①COM组和枸橼酸组细胞Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性均明显低于对照组(P＜0.05);②与枸橼酸组相比,COM组细胞Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性下降更加明显(P＜0.05);③COM组和枸橼酸组细胞培养基中MDA的含量均明显高于对照组(P＜0.05);④与枸橼酸组相比,COM组细胞培养基中MDA的含量更高(P＜0.05).结论外源性枸橼酸能够减轻一水草酸钙晶体对体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞造成的脂质过氧化损伤.
