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去势对人前列腺癌裸鼠移植瘤miR-301a表达水平的影响
目的 探讨人前列腺癌LNCaP细胞荷瘤裸鼠去势后miR-301a和其宿主基因SKA2的表达变化. 方法 制备LNCaP荷瘤裸鼠模型,待肿瘤长至体积为200mm 3时,将LNCaP荷瘤裸鼠随机分成4组,每组6只,2组行去势手术,另2组作为对照组,绘制肿瘤体积变化曲线图.在去势组裸鼠肿瘤体积缩小过程中选择一时间点,处死去势荷瘤裸鼠和对照裸鼠各1组,取出皮下肿瘤称重,作为第1次取材的肿瘤.继续观察另2组裸鼠肿瘤大小,在肿瘤缩小后又再次增长的过程中选择一时间点,处死l组去势荷瘤裸鼠和对照裸鼠,取出肿块称重,作为第2次取材的肿瘤.2次取材均计算抑瘤率,并抽提肿瘤组织RNA,实时定量PCR检测肿瘤miR-301a和SKA2的表达. 结果 LNCaP荷瘤裸鼠自去势手术的第2天,肿瘤体积逐渐减小,至去势后第13天(第1次取材),肿瘤体积缩小为(62.5±21.5)mm3,肿瘤抑瘤率为59.8％,差异有统计学意义(t=-3.895,P=0.018).去势后的第17天,裸鼠肿瘤体积达到小值,随后逐渐增大,在去势后的第41天(第2次取材),肿瘤体积增长为(364.5±97.3)mm3,抑瘤率为62.2％,差异有统计学意义(t=-7.017,P=0.002).第1次取材的肿瘤组织中miR-301a和SKA2在去势组的表达水平显著低于对照组,分别是对照组的65％和50％,差异有统计学意义(P＜0.05).在第2次取材的肿瘤组织中,miR-301a和SKA2的表达水平2组基本一致,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 去势能够使前列腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤从雄激素依赖性转变为雄激素非依赖性,miR-301a和宿主基因SKA2的表达水平随前列腺癌雄激素依赖性质的转变而发生变化,两者具有密切的相关关系.
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miR-301a促进人结肠癌细胞株HT29细胞侵袭与转移的机制
目的 探讨miR-301a对结肠癌侵袭转移的影响及分子机制.方法 实时荧光定量PCR检测40例结肠癌患者癌组织中miR-301a的表达水平,探究结肠癌和miR-301a表达的关系.同时在人结肠癌细胞株HT29细胞过表达和干扰miR-301a,MTT法检测miR-301a对HT29细胞增殖的影响.蛋白免疫技术和实时荧光定量PCR在分子水平上检测miR-301a表达对HT29细胞中侵袭相关分子的表达水平,探究miR-301a调控下的转化生长因子(TGF)-β/Smad4/基质金属蛋白酶(MMP)-9信号通路对结肠癌侵袭转移的影响.结果 实时荧光定量PCR结果显示40例结肠癌患者癌组织中miR-301a的表达水平明显升高,且随着肿瘤分期分级的升高,其水平明显升高.MTT法检测发现过表达miR-301a的HT29细胞数量明显增加,而干扰miR-301a则细胞数目减少,表明miR-301a可促进结肠癌细胞的增殖.在分子水平上蛋白免疫技术和实时荧光定量PCR检测结果显示miR-301a通过下调TGF-β和Smad-4的表达,促进MMP-9的表达,终促进癌细胞的侵袭转移.结论 miR-301a通过下调TGF-β/Smad4信号通路,促进MMP-9的表达,终促进结肠癌的侵袭转移.
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miR-301a在结肠直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞侵袭、迁移能力的影响
目的:分析结肠直肠癌组织miR-301a的表达及其与结肠直肠癌病人临床病理特征的关系.探讨下调miR-301a表达对结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移能力以及PTEN蛋白表达的影响.方法:应用实时定量PCR方法检测48对结肠直肠癌组织和癌旁组织以及5种结肠癌细胞株中miR-301a的表达.应用瞬时转染方法将miR-301a抑制剂转入结肠癌细胞株HCT116后,用细胞增殖实验(CCK-8法)、transwell侵袭实验检测细胞的增殖和侵袭力；采用transwell迁移实验和划痕实验检测细胞迁移能力;并用Western印迹技术检测下调miR-301a后其靶蛋白PTEN表达的变化.结果:PCR结果显示,miR-301a在有淋巴结转移的结肠直肠癌组织中表达较其对应的癌旁组织和无淋巴结转移的癌组织为高(P＜0.05)；5种结肠癌细胞中均有不同程度表达；transwell侵袭、迁移实验显示,miR-301a抑制剂转染后HCT116细胞侵袭、迁移能力明显降低(P＜0.05)；增殖实验显示,下调miR-301a对结肠癌细胞抑制作用明显(P＜0.05).划痕实验表明,miR-301a抑制剂转染组细胞迁移能力明显受到抑制.Western印迹法显示,miR-301a抑制剂转染组细胞PTEN蛋白表达增加.结论:miR-301a在有淋巴结转移的结肠直肠癌组织中表达较高;下调miR-301a的表达抑制HCT116细胞的增殖、侵袭和迁移能力,且PTEN蛋白表达增加.miR-301a对结肠癌细胞生物学功能的影响可能是通过PTEN信号通路实现的.
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应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠
目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型.方法 根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录.利用体外转录的gRNA/Cas9 mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定.结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9 mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5％)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目多的4号小鼠产生31个碱基缺失.结论 成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型.
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑 miR-301a 基因敲除小鼠 -
高糖诱导前列腺上皮细胞微小RNA的差异表达及miR-301a的促增殖作用
目的 检测高糖刺激下微小RNA(miRNA)在前列腺组织及细胞中的差异表达,探讨高血糖对前列腺影响的分子机制.方法 将成年雄性SD大鼠随机分为对照组和高血糖组(＞300 mg/dl),应用miRNA芯片技术检测两组间miRNA表达谱的差异,并通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法验证；以qRT-PCR检测差异表达的miRNAs在高糖(50 mmol/L)培养的RWPE-1细胞中的表达；噻唑蓝(MTT)比色法检测转染miRNAs和/或高糖(25～50 mmol/L)培养的RWPE-1的增殖.结果 高血糖组大鼠前列腺组织中4个miRNA 上调(miR-186 2.405倍、miR-30la 2.202倍、miR-3652.093倍、miR-193 2.317倍),2个miRNA下调(miR-434 0.298倍、miR-361 0.386倍),差异均有统计学意义(P＜0.05)；高糖培养下,RWPE-1细胞中各miRNAs的表达趋势与之一致.MTT实验中25 mmol/L组、50 mmoL/L组、miR-30la转染组的细胞吸光度(A)值分别为起始的175％、197％、188％,与对照组(122％)比较差异有统计学意义(p＜0.05)；50 mmol/L高糖联合miR-301a抑制物转染组的A值为起始的143％,与50 mmol/L组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 体内外高糖条件均可引起前列腺miRNA表达谱变化,高糖通过miR-301a对前列腺上皮细胞的增殖有明显促进作用.
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miR-301a调节小鼠巨噬细胞中炎症因子的表达
目的 探讨miR-301a对巨噬细胞炎症因子表达水平的影响,从microRNA角度阐明动脉粥样硬化的发病机制,为动脉粥样硬化的防治提供新的思路.方法 高脂喂养ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型,收集小鼠主动脉血管,利用real-time PCR检测组织中miR-301a的表达水平;利用脂质体在RAW264.7细胞中转染miR-301amimic和miR-301a inhibitor,用real-time PCR检测细胞中miR-301a水平,并检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达水平,用Western blot检测NF-κB抑制因子(NKRF)蛋白水平,用免疫荧光染色检测p65细胞定位.结果 在高脂喂养的ApoE.-小鼠主动脉血管壁组织中miR-301a的表达水平升高;在RAW264.7细胞中过表达miR-301a可抑制NKRF蛋白水平,促进p65细胞核定位,升高细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达;在RAW264.7细胞中低表达miR-301a可升高NKRF蛋白水平,促进p65细胞质定位,减少细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达.结论 在高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉血管壁组织中miR-301a表达水平升高;在RAW264.7细胞中miR-301a通过调节NKRF的表达影响p65活性进而调控TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达,提示microRNA在动脉粥样硬化发病的炎症机制中具有重要作用.
