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脂质体介导NF-κB圈套寡核苷酸体外转染Kupffer细胞的实验研究
目的 研究核因子κB(NF-κB)圈套寡核苷酸(decoy oligodeoxyribonucleotide,ODN)体外借助阳离子脂质体转染大鼠Kupffer细胞(KCs)的效率,并观察其对KCs活化的抑制作用.方法 24只Wistar大鼠分为3组,每组8只.(1)对照组:分离培养正常大鼠KCs;(2)LPs组:KCs培养液中加入终浓度为1 ms/L的LPS作为刺激因素;(3)NF-κB圈套寡核苷酸组:先用阳离子脂质体(lipofectamine)将人工合成的NF-κB圈套寡核苷酸转染KCs(4μg/1×105个KCs),观察转染效果,再用1 mg/L LPS刺激,观察其对KCs活化的抑制作用,包括KCs的吞噬功能、NF-κB易位,以及膜表面分子CD4O mRNA的表达.结果 在LPS刺激下,KCs呈高度活化状态,吞噬功能增强,NF-κB向细胞核移位,细胞膜表面共刺激分子CD40 mRNA呈高表达状态,与对照组相比差异有统计学意义(t=4.01,P<0.01).在阳离子脂质体介导下,人工合成的NF-κB圈套ODN可以高效转染KCs,有效地抑制NF-κB活化,降低其下游基因的表达,与LPS组相比差异有统计学意义(t=4.89,P<0.01).结论 在脂质体介导下,NF-κB圈套寡核苷酸可以高效转染KCs,并有效抑制KCs的活化.
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NF-κB圈套性寡核苷酸诱导骨髓DC疫苗的实验研究
目的 体外诱导、培养大鼠(Lewis大鼠)骨髓来源改良树突状细胞(DC),为进一步研究核苷酸圈套技术抗移植排斥反应作准备.方法 Lewis大鼠骨髓造血干细胞,体外经重组大鼠细胞因子GM-CSF、IL-4诱导成DC;核因子-κB(NF-κB)圈套寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)用于阻止DC的成熟,降低细胞表面分子的表达,制备改良的DC;LPS用于刺激DC的成熟.流式细胞仪检测DC表面分子CD11c、CD80、CD86等的表达情况,分析DC的细胞特性.结果 体外GM-CSF和IL-4诱导的大鼠骨髓来源DC纯度高、数量丰富.NF-κB decoy ODN能明显降低DC表面分子(CD11c、CD80、CD86等)的表达,表现为非成熟状态;经LPS刺激仍能保持非成熟状态.结论 经NF-κB decoy ODN处理的大鼠骨髓来源DC,其状态稳定,低表达表面分子和共刺激分子,可作为进一步研究的DC疫苗.
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Survivin在NF-κB圈套寡核苷酸促进肝癌细胞HepG2凋亡中的作用
目的 观察核转录因子-κB(NF-κB)圈套寡核苷酸对NF-κB活性的影响,研究Survivin在其诱导肝癌细胞HepG2凋亡中的作用.方法 将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的NF-κB圈套寡核苷酸转染至HepG2细胞中,荧光倒置显微镜和共聚焦显微镜进行核内定位观察,凝胶迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测转染前后NF-κB活性变化;流式细胞仪和TUNEL检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡抑制蛋白Survivin的改变.结果 NF-κB圈套寡核苷酸转染后定位于细胞核内,EMSA显示转染后NF-κB活性明显下降.与未处理组、转染错义组相比,转染NF-κB圈套寡核苷酸组的HepG2细胞凋亡率增加,Survivin蛋白表达下调[(39.8±1.9)、(42.7±2.5)vs(20.1±3.1)].结论 NF-κB圈套寡核苷酸具有促进肝癌细胞HepG2凋亡的作用,其机制可能与下调Survivin的表达有关.
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纳米微载体介导的低氧诱导因子-1圈套寡核苷酸对小鼠HepG2细胞血管内皮生长因子的作用
目的:以低氧诱导因子(HIF)-1为靶点,观察HIF-1转录因子圈套寡核苷酸(HIF-1 decoy ODN))对小鼠HepG2细胞内血管内皮生长因子(VEGF)的作用,在分子水平为肝细胞癌干预靶点提供实验依据.方法:用ELISA法测定小鼠HepG2细胞内VEGF浓度.用逆转录-聚合酶链式反应测定小鼠HepG2细胞内VEGF mRNA.结果:HIF-1 decoy ODN在体外能有效抑制HIF-1活性.Decoy ODN治疗后小鼠mHepG2细胞内VEGF表达明显下降,而变异的decoy ODN无效果.结论:纳米微载体介导的HIF-1 decoy ODN能下调HepG2细胞的VEGF水平.
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核因子-κB圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响
目的 探讨核因子KB圈套寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)转染对小鼠成熟树突状细胞(DCs)生物学特性的影响.方法 体外诱导Balb/c小鼠骨髓细胞生成未成熟DCs(imDCs),经抗原OVA以及LPS孵育后成为OVA冲击的骨髓来源成熟nCs(mDCs),流式细胞仪检测DCs表面分子CDllc以及MHC-Ⅱ的表达予以鉴定;将NF-KB decoy ODN体外转染小鼠骨髓来源成熟DCs,同时设立阴性对照组(转染NF-KB"变异"ODN)以及未转染组,EMSA检测转染后NF-KB的活性变化;流式细胞仪检测各组DCs表面共刺激分子(CIMO、CDSO、CD86)的表达;混合淋巴细胞反应观察各组DCs对OVA致敏的T淋巴细胞增殖的影响.结果 成功培养出骨髓来源成熟DCs;NF-κB decoy ODN转染DCs的NF-KB活性明显降低(P<0.05),DCs表面CD40、CDS0共刺激分子的表达与阴性对照组、未转染组比较无明显改变(P0.05),而CD86的表达与其他各组比较明显降低(P<0.05);在混合淋巴细胞反应中,NF-KB decoy ODN转染DCs对T细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),而阴性对照组与未转染组的DCs具有强烈的激发T细胞增殖的能力(P<0.05).结论 NF-KB decoy ODN转染DCs可能通过CD86的表达降低显著抑制抗原特异性T细胞活化,该改良的DCs有可能用于哮喘的免疫治疗.
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圈套寡核苷酸治疗支气管哮喘的研究进展
STATs和NF-kB信号传导系统在支气管哮喘中起了非常重要的作用.目前治疗哮喘的传统药物由于副作用大、依从性差,很难达到治疗目的.通过阻断信号传导系统来减少或控制哮喘成为近年来的研究新方向,其中圈套寡核苷酸技术凭借其优点成为研究热点,其在哮喘治疗中的应用值得关注.本文将就圈套寡核苷酸针对STATs和NF-kB信号传导系统治疗哮喘作一综述.
关键词： 支气管哮喘 信号传导和转录激活因子 核因子-kB 转录因子 圈套寡核苷酸 -
诱骗寡核苷酸下调MKN-45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响
目的:探讨转录因子E2F哑铃形诱骗寡核苷酸(Decoy ODNs)对MKN-45细胞中op18基因转录调控的影响及对细胞增殖的抑制作用.方法:设计合成针对op18启动子上E2F的结合位点序列的哑铃形Decoy ODNs,然后将合成的序列进行退火、连接,使其形成哑铃形的结构,再应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将哑铃形Decoy ODNs转染MKN-45细胞中.TRIzol法提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测细胞中op18 mRNA表达水平的变化.通过MTT实验监测细胞的生长增殖状况并绘制生长曲线,后用TUNEL法观察细胞的凋亡的情况.结果:哑铃形Decoy ODNs被成功转染MKN-45细胞,并成功提取了细胞总RNA.RT-PCR检测发现哑铃形Decoy ODNs转染后的MKN-45细胞中op18 mRNA表达水平明显低于空白对照组,MTT实验所作的生长曲线显示转染细胞增殖速度与空白对照组相比较明显减慢,TUNEL凋亡染色可见凋亡细胞.结论:哑铃形Decoy ODNs能特异性抑制E2F转录因子对op18基因的转录调控,进而抑制op18基因表达及MKN-45细胞增殖.
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圈套寡核苷酸影响腹腔巨噬细胞炎症介质表达的实验研究
目的设计合成靶向核因子-κB(NF-κB)的哑铃形圈套寡核苷酸(ODNs),并检测其抗炎效应. 方法提取大鼠腹腔巨噬细胞(pMφ),随机分为正常对照组、单纯内毒素(LPS)组、圈套ODNs处理组、无关圈会ODNs处理组和脂质体处理组.收集正常对照组和单纯LPS组LPS刺激后1,2,6,12,18,24 h上清及细胞;采用阳离子脂质体按质量比为4:1的比例分别介导2,4,8 mg/L圈套ODNs转染大鼠pMφ细胞,6 h后用LPS刺激,收集转染后8,12,18 h上清及细胞.细胞免疫组化法分析LPS刺激前后p65表达与分布变化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA转录.结果4,8 mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠pMφTNF-α、IL-6转录和表达.结论靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs具有拮抗炎症介质转录和表达的功能.
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圈套寡核苷酸抑制NIH3T3细胞α2Ⅰ型胶原基因表达的研究
目的研究激活剂蛋白1(activator protein-1,AP-1)圈套寡核苷酸(decoy-oligodeoxynucleotides,Decoy-ODNs)对成纤维细胞α2Ⅰ型胶原表达的影响,探讨病理性瘢痕的基因治疗. 方法设计合成针对AP-1的Decoy-ODNs,用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,观察Decoy-ODNs在细胞中的分布;用凝胶迁移变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究Decoy-ODNs对AP-1的抑制作用,采用RT-PCR观察其对细胞胶原合成的影响. 结果 AP-1的Decoy-ODNs可在体外竞争抑制核转录因子AP-1的活性;阳离子脂质体可以将Decoy-ODNs 转染进入细胞浆及细胞核从而发挥作用;Decoy-ODNs作用24 h后,NIH3T3细胞α2Ⅰ型胶原mRNA的表达明显降低. 结论 Decoy-ODNs可以通过拮抗核转录因子AP-1的活性而抑制α2Ⅰ型胶的表达.
