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8株产变异型CTX-M-14细菌的耐药基因分析
目的 分析本地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的变异株基因序列.方法 使用通用引物经聚合酶链反应,自本地区1999～2000年间分离的确认产ESBLs的98株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中分离出产CTX-M-9组的所有菌株,将PCR产物送交测序公司完成测序,提交GenBank进行比对,并作结构分析.结果 本地区的产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶菌株中有8株变异株存在.结论 合肥市存在新的CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶基因型,来自CTX-M-14.
关键词： 产超广谱β-内酰胺酶 CTX-M-14 基因突变 序列分析 -
CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达
目的 对大肠埃希菌所产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)进行基因克隆和重组表达,探讨其特性.方法 以产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌12号菌总基因组DNA为模板,PCR 扩增CTX-M-14,将其克隆入pUCm-T Vector载体后测定该核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体pET-28α,构建含CTX-M-14基因的重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21中进行IPTG诱导表达.SDS-PAGE电泳鉴定表达的酶蛋白后再过Ni-NTA柱纯化.结果 PCR 扩增出大小为876 bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%.大肠埃希菌BL21转化pET-28α/CTX-M-14重组质粒后,ESBLs试验为阳性.此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量大约为30 KD.结论 成功表达重组的CTX-M-14型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础.
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上海发现同时产CYM-2型质粒AmpC酶及CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌
目的 研究大肠埃希菌同时产质粒型头孢菌素酶(AmpC酶)及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的耐药表型及基因型特点.方法 在242株大肠埃希菌中用多重聚合酶链反应(PCR)检测质粒AmpC酶;对确认为产CIT群质粒AmpC酶的菌株进行PCR、克隆、测序;接合试验证实耐药基因的可传递性;PCR及测序确定ESBL的基因;等电聚焦电泳检测细菌β-内酰胺酶等电点(PI);微量稀释法测定低抑菌浓度(MIC).结果 12株产CIT群酶细菌所携带AmpC酶基因均为blaCMY-2(PI 9.0),且均携带blaTEM-1(PI 5.4),9株同时携带blaCTX-M-14(PI8.0),无菌株携带blaSHV-like;12株产CMY-质粒AmpC酶细菌有4株接合实验阳性,经PCR证实接合子均传递了blaCMY-2,并有1株同时传递了blaCTX-M-14;多数产CMY-2型酶的细菌呈多重耐药,并有1株菌对碳青霉烯类药物耐药.结论 在上海地区首次发现同时产CMY-2型质粒AmpC酶及CTX-M-14型ESBL的大肠埃希菌.
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宋内志贺菌中ESBLs的检测
目的 了解宋内志贺菌中ESBLs的基因型别.方法 琼脂稀释法测定3株宋内志贺菌对β内酰胺类等抗菌药物的耐药性,改良三维试验进行产ESBLs菌株的表型鉴定,并进行转移接合试验;采用TEM、SHV、CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-13组β内酰胺酶基因通用引物以及TEM、CTX-M-13组全编码基因引物进行PCR检测和DNA序列分析;同时对这些菌株进行指纹分析脉冲场电泳(PFGE)检测.结果 3株宋内志贺菌对青霉素类、第一、二代头孢菌素以及庆大霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑显著耐药,对第三代头孢菌素中头孢曲松、头孢噻肟中度敏感,对亚胺培南、头孢美唑、氟喹诺酮类、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶-克拉维酸显示敏感.这些菌株均为产ESBLs菌株,ESBLs基因型别为CTX-M-14,并同时产生TEM-1型广谱β内酰胺酶;CTX-M-14编码基因可以接合方式发生水平转移;3株菌株的PFGE谱型相同.结论 3株宋内志贺菌产生CTX-M-14型ESBLs,引起对多种β内酰胺类抗生素耐药,并存在克隆传播,应加强监测.
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革兰阴性杆菌产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶调查研究(首次发现产blaCTX-M-14的斯氏普罗威登斯菌)
目的 调查某院临床分离的革兰阴性(G-)杆菌产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)株的流行情况,并确定其基因型.方法 收集2004年10月-2005年7月临床标本分离的多重耐药G-杆菌233株,按美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的方法进行ESBLs表型确证试验,聚合酶链反应(PCR)法对表型阳性株进一步进行CTX-M酶基因型的扩增,对PCR产物测序并确定其基因型.结果 从大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌和斯氏普罗威登斯菌中检出CTX-M型ESBLs,首次从斯氏普罗威登斯菌中检出CTX-M-14型ESBLs.结论 该地区多种G-肠杆菌科细菌携带CTX-M型ESBLs,斯氏普罗威登斯菌也能产生CTX-M型ESELs.
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实时定量PCR检测细菌中blaCYX-M-14基因
目的 探索实时定量PCR检测临床、环境细菌中blaCYX-M-14基因流行情况.方法 将收集的65份标本先用ESBL表型确认试验及其KB琼脂扩散法初筛,然后通过菌落平板计数,实时定量PCR方法测出细菌blaCYX-M-14基因C(t)值,终计算得到平均每个待测细菌中的blaCYX-M-14基因的单个拷贝数.结果 从65份标本中分离得到4株产ESBLs的大肠埃希菌,实时定量PCR检测后得到四株细菌的blaCYX-M-14基因C(t)值依次为11.08,11.63,11.80,13.46,拷贝数分别为6.92×107copies/μl菌液,4.67×107copies/μl菌液,4.22×107copies/μl菌液,1.35×107copies/菌液,即1.05copies/细菌,1.90copies/细菌,2.92copies/细菌,1.10copies/细菌.结论 细菌blaCYX-M-14基因拷贝数的高低与细菌多重耐药现象正相关,建立的实时定量PCR检测细菌中blaCYX-M-14基因的方法具有直观,快捷的优点,有助于检测临床及其环境中耐药菌blaCYX-M-14基因流行情况.
