首页 > 文献资料
-
线粒体内膜蛋白表达对肝癌细胞生物学作用研究
目的 线粒体的功能取决于线粒体的膜系统,而线粒体内膜的形态由近期发现的线粒体接触位点复合物(mitochondrial contact site and crista organizing system,MICOS)所调节,MICOS复合物的突变可改变嵴的形成,导致线粒体功能障碍.本研究采用慢病毒shRNA靶向敲低MICOS复合物亚基蛋白-线粒体内膜蛋白Mic19及Mic60表达,并研究敲低Mic19和Mic60对肝癌细胞生物学作用的影响.方法 根据NCBI中的序列设计、构建并包装敲低Mic19及Mic60的重组慢病毒,收集被病毒上清感染后经嘌呤霉素筛选得到的肝癌HepG2阳性细胞,并以空白组、空载pLKO.1慢病毒质粒组作为对照.采用蛋白印迹法检测Mic19及Mic60蛋白的表达,以筛选敲低效率高的稳定细胞株.采用MTT法、划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭情况,观察敲低Mic19及Mic60蛋白表达对肝癌细胞生物学行为的影响.结果 Mic19敲低组中蛋白相对表达量shRNA Mic19-1 (0.579±0.042)和shRNA Mic19-2(0.524±0.111)均低于空白组(1.065±0.105)或空载组(1.07±0.092),差异有统计学意义,均P＜0.01.Mic60敲低组蛋白相对表达量shRNA Mic60-1(0.172±0.107)、shRNA Mic60-2(0.269±0.027)明显低于空白组(1.065±0.105)或空载组(1.07±0.092),差异有统计学意义,均P＜0.01.生长曲线表明,Mic19敲低组至感染第36h时的吸光度(A)值低于对照组,均P＜0.05;Mic60敲低组至感染第12h时的A值显著低于对照组,P＜0.01.划痕实验表明,至第48 h Mic19敲低组细胞迁移距离为(286.8±38.97) μm,Mic60敲低组细胞迁移距离为(214.6±41.64) μm,与空白组(500.8±25.6) μm或空载组(487.3±31.37) μm相比差异均有统计学意义,均P＜0.01.在不铺胶的Transwell迁移实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(440.4±65.35)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(235.2±21.3)个/低倍视野,均少于空白组(574.8±36.4)或空载组(574±53.95)个/低倍视野,均P＜0.01.在铺胶的侵袭实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(172.4±15.5)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(118.2±25.53)个/低倍视野,均少于对照组空白组(238.6±22.85)或空载组(227.8±22.27)个/低倍视野,差异有统计学意义,均P＜0.01.结论 重组慢病毒shRNA Mic19-2、shRNA Mic60 1可分别有效敲低HepG2细胞Mic19、Mic60的表达.慢病毒shRNA靶向敲低Mic19及Mic60表达可抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并为后续进一步研究线粒体内膜蛋白(Mic19、Mic60)对肝癌细胞发生发展的影响提供依据.
-
线粒体内膜蛋白质mitofilin干涉慢病毒的构建及应用
目的 构建线粒体内膜蛋白质mitofilin的慢病毒干涉载体,初步研究mitofilin在体内体外的生物学功能.方法 将靶向人mitofilin基因的短发夹RNA(shRNA)序列克隆到慢病毒核心质粒pSicoR中,瞬时转染HEK293T细胞筛选出有效的干涉片段,并进行慢病毒的包装.病毒感染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,Western印迹检测mitofilin蛋白的干涉效果.15 Gy γ射线照射刺激病毒感染的HeLa细胞,流式细胞术检测细胞凋亡.利用尾静脉大容量快速注射法将慢病毒注射入C57BL/6J小鼠体内,6.5 Gy γ射线照射刺激,蓝色温和电泳联合胶内酶活性染色分析,检测呼吸链复合体Ⅴ活性变化.结果 与结论成功构建具有mitofilin干涉效果的慢病毒干涉载体并获得了稳定干涉mitofilin的HeLa细胞株.构建的慢病毒能有效下调HeLa细胞和小鼠肝脏细胞mitofilin蛋白的表达.干涉mitofilin表达可增加γ射线诱导的细胞凋亡,降低γ射线刺激下小鼠肝细胞线粒体呼吸链复合体Ⅴ的活性.所构建的干涉慢病毒能够广泛应用于mitofilin在体内和体外的功能研究.
