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miR-183对滑膜肉瘤细胞株SW982转移潜能及EGR1表达影响研究
目的 探讨微小RNA-183(miRNA-183)对人滑膜肉瘤细胞株SW982转移潜能的影响,并分析miR-183对早期生长反应因子1(early growth response,EGR1)表达影响的研究.方法 培养人滑膜肉瘤细胞株SW982细胞,采用脂质体转染方法转染miR-183 mimics、inhibitor和negative control,并分为miR-183 mimics模拟物组(mimics组),miR-183 inhibitor抑制剂组(inhibitor组),miR-183 negative control阴性对照组(NC)以及正常对照组(normal).流式细胞术检测各组细胞转染效率;MTT法检测各组细胞转染前后细胞增殖率的改变;Transwell实验检验各组转染前后SW982细胞迁移和侵袭能力的变化;蛋白质印迹法检测各组转染前后EGR1蛋白表达量的变化;双荧光素酶报告基因实验验证EGR1是否为miR-183靶基因.结果 转染miR-183 mimics、inhibitor和negative control后,SW982细胞中miR-183的相对含量明显改变;与正常对照组(1.16±0.52)相比,mimics组(75.30±9.90) miR-183含量明显增加(P＜0.001),inhibitor组(0.22±0.09)miR 183含量明显降低(P＜0.001),NC组(1.06±0.98) miR-183含量无明显变化,P=0.637.MTT法测得转染后24、48、72和96h,SW982细胞增殖率无明显变化.Transwell实验结果显示,在迁移实验中,mimics 组和inhibitor组穿膜细胞数分别为(108.61±4.94)和(54.36±4.03)个,P＜0.001.在侵袭实验中,mimics组和inhibitor组穿膜细胞数分别为(79.13±5.77)和(20.87±3.17)个,P＜0.001.在EGR1表达分析中,转染48h后mimics组中EGR1的相对表达量(286.59±32.77)较正常对照组(373.00±38.40)明显降低,P＜0.001;inhibitor组中EGR1的相对表达量(496.93±42.61)较正常对照组明显增高,P=0.012;双荧光素酶报告基因实验表明,miR-183特异性靶向EGR1基因.结论 转染miR-183 mimics后,miR-183表达增加,SW982细胞转移潜能增强,EGR1表达降低;转染miR-183 inhibitor后,miR-183表达降低,SW982细胞转移潜能降低,EGR1表达增加.EGR1可作为miR-183的潜在靶点.
关键词： microRNA-183 EGR1 滑膜肉瘤 侵袭 迁移 -
老年大鼠学习记忆相关基因egr1表达变化的机制及补肾益气方药的调整作用
目的 探讨DNA甲基化老年大鼠学习记忆相关基因egr1表达变化的机制及补肾益气方药——左归丸、益气聪明汤的调整作用.方法 以自然衰老(24月龄)SD雄性大鼠为动物模型,随机分为老年对照组、老年补肾组、老年益气组、老年合剂组和老年拮抗组,另设一组青年对照组(5月龄).采用RT-PCR法及Western印迹法观察大鼠学习记忆相关基因egr1 mRNA和蛋白表达变化,采用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序法检测基因egr1启动子区甲基化状态,同时观察补肾益气方药对上述指标变化的调整作用.结果 与青年对照组相比,老年大鼠egr1基因mRNA和蛋白表达均明显降低(P＜0.05),其启动子区甲基化增高,左归丸、益气聪明汤能不同程度地改善egr1的表达,并降低egr1启动子区甲基化率.结论 补肾益气方药改善老年大鼠增龄性学习记忆退化可能与抑制基因egr1启动子DNA甲基化而提高egr1的表达有关.
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Egr1介导的人截短型凋亡诱导因子表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律
目的:克隆人截短型凋亡诱导因子(AIF) cDNA序列,并构建早期生长反应因子1(Egr1)介导的重组表达载体pcDNA3.1-Egr1-AIF△1-480(pEgr1-AIF△1 -480),观察其在人乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律.方法:以人白血病Jurkat细胞mRNA为模板,RT-PCR法扩增获得人AIF△1-480,与pMD18T载体连接后行全自动测序,限制性内切酶切取pMD19T-Egr1中Egr1片段,并利用基因重组技术构建Egr1启动子介导的人AIF△1-480表达质粒pEgr1-AIR1-480.实验分为对照组、pcDNA3.1组、pAIF△1-480组和pEgr1-AIF△1-480组.各组质粒分别转染MCF-7细胞,Western blotting法检测AIF及AIF△1 -480蛋白的辐射诱导表达时程-效应(2.0 Gy照射后0、2、4、12、24和48 h)和剂量-效应(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 Gy照射后24 h)规律.结果:经测序证实,RT-PCR获得的人AIF△1-480基因与预期一致,pEgr1-AIF△1-480经PCR和酶切鉴定完全正确;各组MCF-7细胞经2.0 Gy照射后0～48 h,AIF蛋白在各组中均有表达,从4h开始显著增加,4、12、24和48 h各组AIF表达与0h组比较差异有统计学意义(P＜0.05),48 h达到大;而在pAIF△1-480和pEgr1-AIF△1-480组,AIF△1-480从2h开始表达,4、12、28和48 h各组AIF△1-480表达与2h比较差异有统计学意义(P＜0.05),24 h达到峰值;而且24和48 h时pEgr1-AIF△1-480组AIF△1-480表达较pAIF△△1-480组显著增加(P＜0.05).各组MCF-7细胞经0～5.0 Gy照射后24 h,各组均有AIF蛋白表达,而AIF△1-480只在pAIF△1-480和pEgr1-AIF△1-480组表达,二者均随着剂量增加而增加,0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy照射后各组AIF表达与0 Gy比较差异有统计学意义(P＜0.05),在5.0 Gy照射时达到大,相同照射剂量pEgr1-AIF△1-480组AIF△1-480表达高于pAIF△1-480组.结论:成功构建Egr1介导的人截短型AIF重组表达载体pEgr1-AIF△1-480,AIF和AIF△1 -480蛋白在MCF-7细胞中的表达随照射时间延长和照射剂量增加而增加.
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早期生长反应因子对 U87MG 细胞 Aβ40表达的影响
目的：研究早期生长因子 EGR1对 U87MG 细胞 Aβ40表达的影响。方法：构建 EGR1表达质粒并转染U87MG（实验组），以转染空白质粒的 U87MG 细胞作为对照。采用 qRT－PCR 法检测两组 EGR1 mRNA 的表达；收集细胞培养液用 ELISA 法检测 Aβ40的水平；提取总蛋白用蛋白印迹法检测 BACE1和 PS1蛋白的表达。结果：质粒成功构建并表达。实验组 EGR1 mRNA 表达水平较对照组明显增高（P ＜0．001）；实验组细胞培养液中 Aβ40水平较对照组增高（P ＜0．001）；实验组 BACE1蛋白的表达较对照组增加（P ＜0．001）；两组 PS1蛋白的表达差异无统计学意义（P ＝0．367）。结论：EGR1在体外可能使 Aβ40表达增加，且可能与上调 BACE1有关。
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丝裂原调控子CDC20在EGR1基因敲出鼠模型中诱导表达的研究
目的确认肝再生过程中参与调控肝细胞有丝分裂的EGR1靶向基因CDC20, 并对其作用进行评价.方法通过cDNA微阵列分析,比较切肝后48 h野生鼠和EGR1基因敲出鼠的肝组织基因表达.使用RT-PCR法测定再生肝组织中野生鼠和EGR1基因敲出鼠的CDC20基因表达谱,并将其切肝后48h的结果与同一时间点的EGR1蛋白质表达水平进行比较.结果切肝后前12h肝组织CDC20基因的表达水平无变化,但于36h开始上升并于48h达到顶峰,这个表达曲线恰好与肝再生过程中EGR1蛋白质的表达特点一致.此外,与EGR1基因敲出鼠相比,野生鼠切肝后48h的CDC20基因表达水平明显升高(P<0.02).结论 EGR1基因敲出鼠的肝细胞有丝分裂进程受损与肝再生过程中CDC20基因表达水平降低有关;提示:受EGR1调控的CDC20基因的表达在肝再生过程中肝细胞有丝分裂进程中起重要作用.
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EGR1在胃癌细胞系的表达
目的：本实验将研究EGR1在胃癌细胞系、胃癌组织表达，从而为肿瘤的分子分型和临床预后判断提供依据。方法当用TGF-β110ng/ml处理胃癌细胞系后，检测EGR1表达水平改变。结果 TGF-β1以10ng/ml浓度处理胃癌细胞系EGR1在处理803细胞系后48h后mRNA水平增高明显。结论 EGR1基因在脑胶质瘤、子宫平滑肌瘤以及非小细胞癌中表达下调。
