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miR-449a对胰腺癌细胞放射敏感性影响
目的 研究miR-449a对胰腺癌SW1990细胞放射敏感性的影响方法 qRT-PCR检测放疗前后胰腺癌SW1990细胞系中miR-449a的表达变化,利用Lipofectamine 2000转染试剂盒将miR-449a mimics及miR-NC转染到SW1990细胞中,流式细胞术、克隆形成实验检测放射处理后细胞放射敏感性变化.使用TargetScan预测及双荧光素酶报告基因实验证明miR-449a与Cyclin D1的靶向作用,免疫组织化学法观察Cyclin D1在胰腺癌组织和胰腺癌旁5 cm的正常胰腺组织的分布,基因敲除Cyclin D1验证其对胰腺癌细胞放射敏感性的影响.结果 经放射处理后,miR-449a在胰腺癌细胞中的表达量明显降低;过表达miR-449a增加了放射后胰腺癌细胞的凋亡率,并使胰腺癌细胞克隆形成率也明显降低;TargetScan预测及双荧光素酶报告基因实验证实了Cyclin D1是miR-449a的靶标;Cyclin D1蛋白在胰腺癌患者组织中的阳性染色率(70%,35/50)明显高于正常胰腺组织(20%, 2/10),Cyclin D1增加了胰腺癌细胞的放射敏感性.结论 miR-449a通过靶向干扰Cyclin D1的表达,促进胰腺癌细胞的放射敏感性.
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miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7增殖及迁移能力的影响
目的:通过敲低微小RNA(microRNA,miRNA)-449a的方法研究miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖和迁移能力的影响.方法:采用miRNA芯片在乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺细胞MCF-10A筛选具有表达差异的miRNA;化学合成法制备miR-449a的抑制剂(inhibitor),转染后经real-time PCR验证表达的变化;细胞增殖CCK-8实验对转染后细胞增殖能力进行检测;划痕实验检测细胞转移能力,transwell小室实验检测细胞侵袭的改变;蛋白免疫印迹法(Western blot)实验对MCF-7细胞增殖和迁移相关的β-catenin和E-cadherin蛋白进行检测;通过生物信息学软件预测miR-449a潜在靶基因为Notch 1,荧光素酶实验检测Notch l是miR-449a的靶基因.结果:分别收集MCF-7和MCF-10A细胞,芯片结果显示miR-449a在MCF-7细胞的表达水平显著高于MCF-10A;本研究将细胞分为未处理组(Mock组),阴性对照组(negative control组,NC组)和处理组,通过收集不同组MCF-7细胞进行试验,CCK-8结果显示miR-449a下调后MCF-7细胞增殖能力显著降低;划痕实验结果显示miR-449a表达降低导致MCF-7细胞转移能力降低;transwell实验结果显示MCF-7细胞侵袭受到抑制;Western blot结果发现miR-449a敲低后β-catenin表达降低,E-cadherin表达增加;荧光素酶试验结果显示,miR-449a能够显著降低Notch 1-3'-UTR质粒的荧光素活性(P＜0.01).结论:在乳腺癌细胞MCF-7中敲低miR-449a能够显著抑制癌细胞增殖和迁移,而这一变化可能通过降低Notch 1蛋白表达实现的.
关键词： miR-449a 人乳腺癌MCF-7细胞 Notch1 增殖 迁移 -
miR-449a靶向调节c-Met抑制Hela细胞的迁移和侵袭
目的：探讨microRNA-449a （miR-449a）在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌进展的作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）测定miR-449a及其靶向调节分子c-Met在宫颈癌组织及正常宫颈标本（对照组）中的表达水平。构建转染miR-449a高表组（miR-449a组）、转染c-Met干扰质粒组（siRNA组）和相应的空载质粒组（mock组），qPCR检测miR-449a和c-Met mRNA表达量；免疫印迹法检测c-Met、MMP2和MMP9蛋白水平变化；细胞划痕修复和Transwell侵袭试验进一步观测miR-449a和c-Met对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 miR-449a在宫颈癌组织中表达量低于对照组（P<0.05），c-Met mRNA在宫颈癌组织中的表达高于对照组（P<0.05），两者间呈负相关关系（r=-0.32，P<0.05）。在宫颈癌细胞Hela细胞中过表达miR-449a后，c-Met mRNA的表达水平降低（P<0.05），并且蛋白水平也明显降低。miR-449a能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05），抑制c-Met表达后也能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）。结论 miR-449a通过靶向抑制c-Met的表达抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。 miR-449a可能是潜在的宫颈癌筛查和诊断分子标志物，并为宫颈癌个体化治疗提供一个新的方向。
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中国人群miR-449a单核苷酸多态性与胃癌易感性的相关性研究
目的 探讨miR-449a rs112310158基因多态性与胃癌易感性的关系.方法 共纳入448例胃癌患者和452例健康对照者.miR-449a rs112310158基因型检测采用聚合酶链反应结合直接测序方法.miR-449a表达水平检测采用荧光定量PCR方法.此单核苷酸多态性位点功能由RT-PCR和免疫组化试验验证.结果 相对于对照组,胃癌病例组在吸烟者(OR=1.345,95 ％CI=1.028～1.761)、饮酒者(OR=1.910,95％CI=1.465～2.490)、有肿瘤家族史者(OR=4.178,95％CI=1.554～11.231)、幽门螺杆菌感染率较高者(OR=1.428,95％CI=1.098～1.857),差异均具有统计学意义.相较AA基因型,GG基因型显著增加胃癌的发病风险(OR=2.542,95％CI:1.304～4.954,P=0.005).相较于A等位基因,携带G等位基因的个体罹患胃癌的风险升高(OR=1.279,95％CI:1.012～1.617,P=0.043).GG型患者比AA型患者miR-449a表达水平下降.与AA基因型相比,miR-449a靶基因PRKCE在GG基因型胃癌患者中有更高的表达.结论 该研究发现miR-449a rs112310158是胃癌的遗传易感因素之一.
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miR-449a在乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型中的作用
目的 探究敲低miR-449a对裸鼠皮下乳腺癌细胞移植瘤生长的影响.方法 本实验通过采用乳腺癌MCF-7细胞系建立乳腺癌的裸鼠皮下移植瘤动物模型,将含有shRNA-miR-449a表达的质粒稳定转染MCF-7细胞,将筛选的稳转细胞采取多点注射的方法注入裸鼠皮下,采用阴性质粒为阴性对照,PBS作为空白对照;处理裸鼠后检测成瘤体积并计算肿瘤生长抑制率;Real-time PCR检测肿瘤组织miR-449a、Notch 1表达情况;Western blot检测移植瘤组织内的Notch 1、β-catenin和E-cadherin蛋白水平;免疫组织化学技术检测肿瘤组织内Notch1、E-cadherin表达水平.结果 移植瘤形成过程中裸鼠未出现死亡,肿瘤体积检测后发现miR-449a敲低后能够显著抑制肿瘤的生长(P<0.05);miR-449a在移植瘤组织内表达降低,同时Notch 1蛋白表达降低,β-catenin表达降低,而E-cadherin蛋白表达升高;免疫组化结果也显示Notch 1蛋白水平降低,E-cadherin蛋白的表达水平升高(P<0.05).结论 敲低miR-449a可能是通过下调Notch 1、β-catenin蛋白水平,促进E-cadherin蛋白表达,从而抑制乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长.
