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胃癌及其转移灶中S100A6基因的表达
目的 分析S100A6在胃癌发展过程中的作用,研究配对胃癌组织以及转移灶中S100A6基因mRNA和蛋白的表达.方法 应用实时定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)检测20例配对胃癌组织中S100A6 mRNA的表达,构建208例胃癌患者配对胃癌组织及转移淋巴结病灶的组织芯片,采用免疫组化方法检测S100A6蛋白的表达,并分析其与临床病理因素以及预后之间的相关性.结果 QRT-PCR检测结果显示,20例配对胃癌中,有14例的S100A6 mRNA转录水平升高,平均升高倍数为2.25倍.免疫组化检测结果显示,S100A6在正常胃黏膜中的表达阳性率为34.3%,在癌灶中表达阳性率为84.1%,在淋巴结转移灶中表达阳性率为90.9%,癌灶和淋巴结转移灶表达高于正常胃黏膜(P<0.05).65.5%的胃癌组织中S100A6表达较对应正常胃黏膜升高.癌灶中S100A6表达与肿瘤大小和侵袭程度相关,肿瘤越大表达越高(P=0.022),侵袭越深表达越高(P=0.000),未发现S100A6表达与其他临床病理因素之间的相关性.S100A6表达与预后无关,但相对于正常胃黏膜,癌灶中S100A6表达升高者的预后比表达下降者差.结论 S100A6表达上调是胃癌早期事件,与胃癌的发生、发展相关.
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S100A6基因过表达慢病毒载体的构建、转染及鉴定
目的 构建S100A6基因重组慢病毒质粒,经293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,并感染A549细胞,实现在细胞中高效、稳定表达. 方法 PCR扩增S100A6基因序列,将目的基因与酶切线性化载体pLenO-DCE定向连接,转化E.Coli DH5α感受态细胞,对阳性重组子进行DNA测序及比对.将构建成功的目的质粒和辅助包装质粒共转染293T细胞生产病毒液,荧光显微镜观察报告基因在293T细胞中的荧光表达,判断重组慢病毒的感染效率.用得到的病毒液转染人肺腺癌A549细胞,real-time PCR和Western blot检测转染A549细胞后S100A6蛋白和S100A6 mRNA的表达. 结果 测序提示重组慢病毒质粒构建成功;荧光显微镜观察显示在包装细胞中获得较高的转染效率.real-time PCR检测显示A549细胞中有S100A6 mRNA表达;Western blot显示S100A6蛋白在A549细胞中稳定表达. 结论 成功构建S100A6基因慢病毒表达载体,并成功感染A549细胞,实现在细胞中高效、稳定表达,为S100A6基因功能及特性的研究和探索提供了实验基础.
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S100A6基因干扰对A549肺腺癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨S100A6基因干扰对A549肺腺癌细胞生物学行为的影响.方法 构建S100A6基因RNAi载体,慢病毒转染A549肺腺癌细胞,共分为3组,①空载体对照组:转染不携带S100A6基因RNAi的空载质粒;②阴性对照组:未转染任何质粒;③S100A6 RNA干扰组:携带S100A6基因RNAi的质粒.应用实时聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting鉴定S100A6基因和蛋白表达;采用四甲基偶氮唑蓝、迁移试验和流式细胞仪分别检测细胞增殖、浸润、细胞周期及细胞凋亡等生物学特性.结果 S100A6基因干扰后A549肺腺癌细胞S100A6 mRNA的表达(0.009±0.001)较阴性对照组(0.049 ±0.005)和空载体对照组(0.030 ±0.006)均有明显下降,差异均有统计学意义(=57.56,P=0.000;t=48.21,P=0.000).S100A6基因干扰后A549肺腺癌细胞S100A6蛋白的表达(0.107±0.002)较阴性对照组(0.341 ±0.005)和空载体对照组(0.311 ±0.006)均有明显下降,差异均有统计学意义(t=37.34,P=0.000;=27.51,P=0.001).48 h细胞增殖能力:RNA干扰组(0.230 ±0.008)较阴性对照组(0.292 ±0.038)和空载体对照组(0.307 ±0.013)降低,差异均有统计学意义(t=25.31,P=0.003;t=29.42,P=0.001).细胞浸润能力:RNA干扰组细胞的穿膜细胞数(11.40个±1.36个)较阴性对照组(26.80个±1.83个)和空载体对照组(25.80个±1.93个)降低,差异有统计学意义(t=29.44,P=0.001;t=23.17,P=0.005).细胞周期:RNA干扰组的S期细胞比例(28.26％±0.38％)显著低于空载体对照组(44.73％±0.66％)和阴性对照组(45.15％±1.69％),差异有统计学意义(t=63.69,P=0.000;t =71.55,P=0.000),RNA干扰组的G2-M期细胞比例(26.99％±0.29％)显著高于阴性对照组(13.26％ ±0.49％)和空载体对照组(12.41％±0.46％),差异有统计学意义(t=56.31,P=0.000;t =51.39,P=0.000).RNA干扰组细胞凋亡率(8.90％±0.48％)与阴性对照组(5.84％±0.21％)和空载体对照组(5.99％±0.37％)比较,差异均有统计学意义(t=51.34,P=0.000;t=47.27,P=0.000).结论 S100A6基因参与肺腺癌细胞的增殖、浸润、细胞周期、细胞凋亡等生物学过程,与肿瘤发生、发展、转移等密切相关,有望作为肺腺癌诊断和治疗新的分子靶标.
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S100A6基因对胃癌细胞生物学特性的影响
目的 探讨S100A6基因对于胃癌细胞增殖状态、细胞周期、凋亡状态等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响.方法 将S100A6基因插入载体 pcDNA3.1构建PC-S100A6真核表达载体.以脂质体介导转染MKN45胃癌细胞建立稳定转染细胞系(MKN-S100A6),而后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、细胞迁徙实验法等方法分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化.同时设立空载体转染组和空白细胞组为对照.结果 与转染pcDNA3.1空载体及空白MKN45胃癌细胞相比,转染PC-S100A6载体的稳定表达细胞株生长显著加快,前5日细胞计数差异有统计学意义(P<0.05),后两组之间亦无显著差异,细胞周期检测显示PC-S100A6转染组处于G2-M期的细胞比例显著高于未处理的MKN45细胞和转染pcDNA3.1空载体的MKN45细胞(P<0.05),而处于S期的细胞比例显著低于其他两组(P<0.05),其他各期细胞比例差异均无统计学意义.流式细胞仪法检测细胞凋亡结果显示各组细胞的凋亡比例均为0.8%左右.统计学检验差异无统计学意义(P>0.05).平板克隆形成实验结果显示PC-S100A6转染组平均克隆形成率显著高于其他两组(P<0.05),细胞迁徒实验结果 提示PC-S100A6转染组穿膜率显著高于其他两组(P<0.05).结论 S100A6基因可能具有促进细胞生长增殖及分裂作用,同时可影响细胞周期,增加处于分裂期细胞的比例,可能具有促进细胞分裂作用,但对细胞凋亡的影响作用较小.S100A6基因可能加强胃癌细胞侵袭转移能力.总之该基因对维持细胞恶性表型有一定意义.
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降低S100A6基因表达对胃癌细胞生物学特性影响的研究
目的:初步探讨S100A6基因对于胃癌细胞生长、增殖状态,细胞周期,凋亡状态等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响.方法:S100A6基因的RNAi载体通过脂质体介导法转染S100A6基因高表达SGC7901细胞,后经G418压力筛选法获得稳定转染的细胞系,经过RT-PCR法、免疫细胞化学法及Western-bloting法证实.对稳定表达株进行鉴定,而后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、细胞迁徙实验等方法分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化,每种检测实验均设立RNAi载体稳定转染细胞组、IMG800空载体稳定转染细胞组和空白SGC7901细胞组.结果:稳定的S100A6基因RNAi细胞系经过RT-PCR法、免疫细胞化学法及Western-bloting法证实,mRNA抑制率可达75%左右,蛋白产物的抑制率达85%左右.与转染IMG800空载体及空白SGC7901胃癌细胞相比转染S100A6 RNAi载体的稳定表达细胞株生长减慢,各时间点细胞计数显著低于对照组(P<0.05);后两组之间亦无显著差异,细胞周期检测显示S100A6 RNA干扰组G0-G1期比例显著高于对照组,而G2-M及S期比例显著低于对照组(P<0.05),其它各期细胞比例均无显著差异.平板克隆形成实验结果显示S100A6 RNA干扰组克隆形成率显著低于对照组(P<0.05);,细胞迁徙实验结果提示S100A6 RNA干扰组穿膜率显著低于对照组(P<0.05).结论:S100A6基因可能具有促进细胞生长增殖作用,同时可影响细胞周期,增加处于分裂期细胞的比例可能具有促进细胞分裂作用,并可促进胃癌细胞侵袭转移.降低S100A6基因表达可能抑制胃癌细胞的恶性生物学行为.
