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淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素体外抑制猴免疫缺陷病毒复制作用
目的 观察淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素体外对猴免疫缺陷病毒的抑制作用.方法 用CCK-8检测不同浓度的淫羊藿苷与代谢产物脱水淫羊藿素对CEMx174细胞的毒性;以SWmac251感染CEMx174细胞为模型,观察细胞病变效应(CPE);实时套式反转录荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内猴免疫缺陷病毒(SIV)核糖核酸(RNA)相对量和上清中病毒载量三个指标,来评估淫羊藿苷与代谢产物脱水淫羊藿素对SIV复制的抑制作用.结果 淫羊藿苷和脱水淫羊藿素的大无毒浓度分别是50μg·mL-1,16 μg·mL-1.在细胞内,淫羊藿苷(50,25,12.5 μg·mL-1)和脱水淫羊藿素(16,8,4 μg·mL-1)组SIV RNA相对量都明显比病毒对照组低(P＜0.01,P＜0.05),且具有一定的量效关系.同时在上清中,淫羊藿苷(50,25 μg·mL-1)和脱水淫羊藿素(16,8,4μg·mL-1)组病毒载量明显比病毒对照组低(P＜0.01,P＜0.05),也存在一定的量效关系.以上药物浓度与病毒对照组比较均具有统计学差异.结论 淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素均对SIV的复制起到抑制作用,具有深入研究和开发的前景.
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脱水淫羊藿素与山柰素对体外培养成骨细胞成熟矿化影响的比较研究
比较研究脱水淫羊藿素与山柰素对体外培养大鼠成骨细胞(rat osteoblasts,ROB)增殖与成熟矿化的影响.取新生SD大鼠颅骨,多次酶消化法获得成骨细胞,培养于含10％ FBS的MEM培养液中,3天后首次换液,铺满皿底90％以上后传代培养.分别用1×10-4、1×10-5、1x10-6和1×l0-7 mol·L的脱水淫羊藿素和山柰素进行药物干预,增殖分析采用MTT法,诱导培养9天后检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,筛选出佳浓度.采用佳浓度的脱水淫羊藿素和山柰素进行药物干预,比较脱水淫羊藿素、山柰素和对照组之间的ALP、钙盐沉积量、骨钙素分泌量、CFU-FALP和矿化结节数量等成骨性指标.提取总RNA,实时荧光定量PCR(real time PCR)检测BMP-2、Osterix(OSX)及Runx-2的mRNA表达情况,同时提取总蛋白,Western blotting法检测I型胶原蛋白的分泌量.结果表明,1x10-4 mol.L-1脱水淫羊藿素和山柰素对细胞增殖有抑制作用；1x10-5mol·L-1脱水淫羊藿素虽对ROB增殖无明显影响,但能显著提高成骨细胞中ALP活性、钙盐沉积量和骨钙素分泌量,增加CFU-FALP和矿化结节数量,与成骨细胞成熟矿化相关的因子BMP-2、OSX和Runx-2的基因表达量也显著升高,同时I型胶原蛋白的分泌量也明显增多；而山柰素并没有表现出促进体外培养ROB成熟矿化的特性.脱水淫羊藿素促进成骨细胞成熟矿化的作用明显高于山柰素,很可能是由脱水淫羊藿素8位C原子上存在的异戊烯基引起的.
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淫羊藿素和脱水淫羊藿素对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响的比较研究
目的 比较研究淫羊藿素和脱水淫羊藿素对体外培养大鼠骨髓阃充质干细胞(rat bone marrow stromal cells,rBMSCs)成骨性分化的影响.方法 贴壁筛选法体外培养rBMSCs,以1×10-5mol·L-1的淫羊藿素和脱水淫羊藿素对rBMSCs的成骨性分化进行药物干预,比较淫羊藿素组、脱水淫羊藿素组以及不加药的对照组之间碱性磷酸酶(ALP)活性、ALP阳性克隆数(colonies stained positive for alkaline phosphatase,CFU-FALP)、骨钙素分泌量、钙盐沉积量以及钙化结节数量的差异,Real Time RT-PCR法检测IGF-1、Osterix和Runx-2的基因表达情况.Western-blot法检测Ⅰ型胶原蛋白的分泌量.结果 淫羊藿素可显著增强rBMSCs的ALP活性,促进钙盐沉积和骨钙素的分泌,增加CFU-FALP和钙化结节数量,提高IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA水平,同时也可增强Ⅰ型胶原蛋白的分泌,而脱水淫羊藿素并未表现出类似效应.结论 淫羊藿素促进rBMSCs成骨性分化的活性显著高于脱水淫羊藿素,可能是二者异戊烷链上的构型差异,导致淫羊藿素的生物活性强于脱水淫羊藿素,提示我们可以通过对药物进行化学结构的改造,增强药效,降低毒性,从而研究开发出新型抗骨质疏松药物.
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基于UPLC-Q-TOF-MS的淫羊藿化学成分分析
目的 建立超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法(UPLC-Q-TOF-MS)快速鉴定淫羊藿饮片中的化学成分.方法 采用Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.4 mL/min,柱温35℃,进样量5 μL.质谱采用电喷雾(ESI)离子源,在负离子模式下采集数据,通过保留时间、精确相对分子质量和二级质谱碎片对检测到的化学成分进行鉴定.结果 检测到淫羊藿饮片中以脱水淫羊藿素为母核的黄酮类成分17个、以去甲基脱水淫羊藿素为母核的黄酮类成分6个、其他类型化合物6个.再通过分析10批样品中的化学成分,确定了淫羊藿饮片中16个普遍存在的化学成分.结论 UPLC-Q-TOF-MS方法能快速、准确、较全面地鉴定淫羊藿饮片中的化学成分;淫羊藿化学成分的鉴定及普遍存在化学成分的确定为其药效物质基础和质量控制研究提供了实验依据.
关键词： 淫羊藿 超高效液相色谱-飞行时间质谱 黄酮类 脱水淫羊藿素 去甲基脱水淫羊藿素 -
脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对MCF-7、MDA-MB231细胞株增殖的影响研究
目的 比较脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对受体状态不同的人乳腺癌细胞株增殖的影响.方法 运用MTT法研究不同浓度的脱水淫羊藿素与金雀异黄酮对MCF-7、MDA-MB231细胞增殖的影响,并以雌激素受体阻断剂ICI182,780和雌激素受体激动剂DPN、PPT为工具药来评价脱水淫羊藿素和金雀异黄酮雌激素样作用与雌激素受体(ERs)的关系.结果 脱水淫羊藿素和金雀异黄酮终浓度为10-13~10-7 mol/L时,MCF-7细胞株增殖均随浓度升高而增加,呈一定的剂量相关性;而各受试药物任何浓度对MDA-MB231细胞株均无显著增殖效果.加入终浓度为10-8 mol/L的ICI182,780时,MCF-7细胞增殖作用被拮抗,MDA-MB231细胞增殖无明显变化.加入终浓度为10-8 mol/L的ERα 受体通路激动剂PPT时,MCF-7细胞增殖率明显增高(P<0.05),MDA-MB231细胞增殖无明显变化.加入终浓度为10-8 mol/L的ERβ受体通路激动剂DPN时,MCF-7和MDA-MB231细胞增殖均无明显变化.结论 脱水淫羊藿素与金雀异黄酮在一定剂量范围内均有雌激素样作用,两者作用相当,体外实验促进MCF-7细胞增殖作用可能主要是由ERα 介导,而非ERβ 介导.
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淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素促血管内皮细胞增殖的初步机制研究
目的：研究淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素脐静脉血管内皮细胞的影响。方法体外培养人脐静脉血管内皮细胞，用CCK－8法检测淫羊藿苷和脱水淫羊藿素（1μM）对血管内皮细胞的增殖能力影响。 Real－time PCR法检测与血管形成相关基因的表达，探讨淫羊藿苷和脱水淫羊藿素对血管形成的分子机制。结果淫羊藿苷和脱水淫羊藿素均具有轻微的促血管内皮细胞增殖的作用。 Real－time PCR结果显示，淫羊藿苷可以上调血管内皮生长因子（ VEGFA）、乏氧因子（ HIF－1α）和金属基质蛋白酶（MMP－2）表达，下调单核细胞趋化蛋白（MCP－1）和白细胞介素（IL－8）基因表达。脱水淫羊藿素则可以上调上述所有基因表达。结论淫羊藿苷可以单独或通过其代谢产物脱水淫羊藿素上调血管形成相关基因VEGFA、HIF－1α、MMP－2、MCP－1和IL－8基因表达，进而促进血管内皮细胞增生及血管形成。
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脱水淫羊藿素促进骨髓间质干细胞修复裸鼠临界性颅骨缺损的实验研究
目的：研究脱水淫羊藿素在体内对裸鼠临界性颅骨缺损修复的影响。方法体外培养并流式细胞仪鉴定人骨髓间质干细胞；建立裸鼠颅骨临界性骨缺损，用脱水淫羊藿素及脱水淫羊藿素复合骨髓间质干细胞修复骨缺损。修复2个月后，用micro－CT检测脱水淫羊藿素的骨缺损修复能力的影响。结果分离并培养了人骨髓间质干细胞，流式细胞仪证实人骨髓间质干细胞是一群CD73＋CD90＋CD34－CD45－细胞。 Micro－CT结果显示，与空白对照组对比，脱水淫羊藿素组的新增骨量增加。而脱水淫羊藿素复合骨髓间质干细胞后可以显著提高骨缺损处的新骨形成量（ P＜0．01）。结论脱水淫羊藿素在体内具有促进骨缺损修复作用，而脱水淫羊藿素复合骨髓间质干细胞可以显著增强骨缺损修复能力。
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脱水淫羊藿素对老年大鼠的抗氧化作用
目的 研究脱水淫羊藿素对衰老大鼠的抗氧化作用.方法 以10只2月龄雌性SD大鼠为青年大鼠组,以20只12月龄的SD大鼠为实验组,分为老年大鼠组和服药组.服药组每日灌服25 mg/kg脱水淫羊藿素,老年大鼠组和青年大鼠组灌服给予等体积蒸馏水.2个月后麻醉处死大鼠.取血清检测丙二醛(MDA)含有量,同时检测血清中抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性.剥离大鼠肝脏和脑组织,研磨后检测脂褐质(Lf)含有量,检测组织中SOD、CAT和GSH-Px活性.研磨肝脏提取总RNA后,RT-PCR检测SOD和CAT mRNA表达量.结果 与青年大鼠相比,老年大鼠血清MDA含有量显著升高,肝脏和脑组织Lf含有量明显增加.同时血清和组织中抗氧化因子SOD、CAT和GSH-Px活性显著下降.老年大鼠服药后,服药组和老年大鼠组相比,MDA和Lf含有量显著降低,血清和组织中抗氧化因子SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高.SOD和CAT mRNA表达检测结果显示,衰老后SOD和CAT mRNA表达显著降低,当服用药物后SOD和CAT mRNA表达显著升高.结论 脱水淫羊藿素能够显著提高老年大鼠体内抗氧化因子的活性,对于老年大鼠具有很好的抗氧化作用.
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淫羊藿苷及脱水淫羊藿素对人牙髓细胞增殖和成矿能力的影响
目的：观察淫羊藿苷及脱水淫羊藿素对人牙髓细胞增殖和成矿能力的影响。方法将人牙髓细胞随机分为观察A组、观察B组和对照组。观察A、B组分别加入不同浓度淫羊藿苷、脱水淫羊藿素，对照组不予处理。采用CCK-8法检测各组增殖能力（以OD450表示），Real-time PCR法检测骨钙素（OCN）和牙本质涎磷蛋白（DSPP） mRNA，碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察各组成矿能力。结果观察A组加入0．1、1、10μmol／L淫羊藿苷后OD450分别为1．86±0．08、1．96±0．07、1．82±0．04，观察B组加入0．1、1、10μmol／L脱水淫羊藿素后OD450分别为1．90±0．07、1．93±0．09、1．88±0．02，对照组为1．76±0．10；观察A、B组均高于对照组，P均＜0．05；观察A、B组比较，P均＞0．05。观察A、B组OCN、DSPP mRNA表达均高于对照组，P均＜0．05；观察A、B组比较，P均＞0．05。在成骨诱导剂存在情况下，观察A、B组和对照组的染色结果无明显差别。结论淫羊藿苷和脱水淫羊藿素均能提高人牙髓细胞的增殖和成矿能力，但成矿能力与成骨诱导剂相比作用较微弱。
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脱水淫羊藿素对腹膜炎小鼠的保护作用
目的 研究脱水淫羊藿素(AHI)对酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎的影响.方法 采用酵母多糖诱导腹膜炎模型,观察各组小鼠的生存情况,收集腹腔液,分别进行白细胞计数,Griess试剂联合酶标仪检测一氧化氮(NO)、流式细胞术检测小鼠腹腔渗出液中IL-6、IL-10、TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的水平；采用Fluo4-AM标记,激光扫描共聚焦显微镜实时检测AHI对骨髓巨噬细胞钙离子内流的影响；Western blot法检测AHI对一氧化氮合酶(iNOS)的影响.结果 4 mg/kg体质量的AHI能提高腹膜炎小鼠的存活,减少腹腔白细胞的数量,降低NO、IL-10、TNF-α、MCP-1、IL-6的分泌；5μmol/L的AHI能抑制小鼠巨噬细胞的钙内流和iNOS的表达.结论 AHI对酵母多糖诱导的腹膜炎小鼠具有保护作用,可能与抑制巨噬细胞的钙离子内流、iNOS表达有关.
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脱水淫羊藿素对小鼠巨噬细胞免疫功能的影响
目的:研究脱水淫羊藿素(AHI)在体外对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞免疫功能的影响.方法:分离制备小鼠骨髓来源巨噬细胞；CCK-8法检测不同终浓度的AHI对巨噬细胞的毒性；采用Griess试剂盒检测AHI对巨噬细胞产生NO的影响；流式细胞术(FCM)检测AHI对巨噬细胞吞噬E.coli颗粒的影响；利用FCM结合双色免疫荧光染色技术检测AHI对巨噬细胞早期活化标志CD69的表达情况；使用流式液相蛋白定量检测技术(CBA)检测AHI对LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子的影响.结果:终浓度为2.5、5、10 μmol/L的AHI对活化的小鼠巨噬细胞均具有明显的免疫抑制作用,特别是5 mol/L AHI能明显抑制经LPS刺激的巨噬细胞早期活化,释放NO,吞噬E.coli颗粒,以及分泌IL-6、MCP-1、TNF和IL-12p70四种细胞因子.结论:AHI对LPS诱导的小鼠巨噬细胞的活化具有明显的抑制作用,是一种潜在的免疫抑制剂.
