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人毛囊无色素黑素细胞培养方法的改良及色素生成相关酶表达的研究
目的 进一步改良人毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)培养的方法,并研究了AMMC内黑素生成相关酶的表达:酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinaso related protein-1.TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(tyresinase related protein-1,TRP-2).方法 采用1%分离酶(dispase)消化分离毛囊,选用含干细胞因子(stem cell factor,SCF)、内皮素-3(endothelin-3,ET-3)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast grow factor,bFGF)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)的成黑素细胞培养基培养AMMC,同时培养表皮黑素细胞(melanoeytes,MC)作为对照,采用免疫组化、多巴染色和透射电镜对细胞进行鉴定,蛋白印记法分析TYR、TRP-1和TRP-2的表达.结果 1%分离酶消化24h可以容易获得游离的毛囊,结合我们所用的培养基完全排除了成纤维细胞的污染.所用成黑素细胞培养基促AMMC增殖明显,细胞可传5代以上.免疫组化结果显示,AMMC表达gp100、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(tyrosinase related protein-1,TRP-2),证明培养的细胞为黑素细胞.AMMC的多巴染色呈阴性,并且透射电镜发现AMMC胞质中仅含大量的Ⅰ期、Ⅱ期黑素小体,未见Ⅲ、Ⅳ期黑素小体,因此说明AMMC处于未分化状态.TYR和TRP-1在MC中的表达明显强于AMMC,TRP-2的表达在两种细胞间没有明显差别,进一步说明AMMC与MC具有异质性.结论 我们成功培养了完全纯化、快速增殖的AMMC,并且培养的细胞不能生成黑素,生物学性状更接近活体中的状态,其与表皮黑素细胞具有异质性.
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人头皮毛囊外根鞘无色素黑素细胞的分离和纯化培养进一步研究
目的:从人头皮毛囊外根鞘分离纯化培养无色素黑素细胞.方法:采用两步酶法(0.50%分离酶和0.50%胶原酶Ⅴ)获得游离的毛囊,高浓度0.50%胰酶30 min消化游离的毛囊外根鞘细胞,并以优化的培养基进行细胞培养.用HMB-45和NKI/beteb单克隆抗体免疫组化染色、透射电镜对培养物进行鉴定.结果:培养物中初始贴壁细胞大多数为无色素黑素细胞,仅有少量的角质形成细胞,无成纤维细胞污染.经二次传代差别胰酶处理很容易去除角质形成细胞.取培养3周的细胞经免疫组化和透射电镜鉴定证实为无色素黑素细胞.传3代后细胞得到完全纯化.结论:两步酶法结合高浓度的胰蛋白酶处理细胞可彻底清除成纤维细胞,获得无色素黑素细胞的纯培养.
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人毛囊无色素黑素细胞培养的纯化和培养基成分对细胞影响的实验研究
目的:研究geneticin在毛囊黑素细胞培养过程中对成纤维细胞的去除作用,研究12-O-十四烷佛波酯-13-醋酸酯(TOPA)和含牛垂体提取物(BPE)角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)对毛囊无色素黑素细胞(AMMC)形态和增殖的影响.方法:通过胶原酶法培养毛囊黑素细胞,观察不同浓度geneticin对污染的成纤维细胞的去除.同时观察不同浓度TPA和含BPE的KSFM对AMMC形态和促增殖的影响.结果:采用100μg/mL geneticin处理2 d后,剩余细胞主要是黑素细胞,其中部分成纤维细胞呈死亡状态,继续培养至第7天后,黑素细胞的纯度达到90%以上.50ng/mLTPA可以促进细胞增殖,与100ng/mLTPA比较差异无显著性(P＞0.05),但对细胞形态影响不大;100ng/mLTPA明显促进黑素细胞的树突增加.含20%、40%和80%的K-SFM(含BPE)培养基中,浓度为80%时促增殖作用明显.结论:100μg/mLgeneticin作用2 d去除黑素细胞培养中污染的成纤维细胞是一种简单有效的方法,并可重复使用.在毛囊黑素细胞培养中,TPA以50 ng/mL的浓度即可明显促进增殖,而不影响细胞的形态.含BPE的K-SFM可以浓度依赖性地促进AMMC增殖.
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维A酸促毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞分化的实验研究
目的:研究维A酸(all-transretinoic acid ATA)对毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)的激活作用.方法:以高、中、低3种不同浓度的ATA作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,倒置显微镜观察细胞形态的变化,细胞计数法测定ATA对AMMC增殖率的影响,通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前后AMMC酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)表达的变化.结果:ATA能抑制AMMC的增殖,并能促进AMMC表达TYR和TRP-1,但对TRP-2的表达没有影响.结论:ATA能够促进AMMC的分化,同时抑制增殖,其抑制机制可能与凋亡有关.
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人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和鼠黑素瘤细胞的原子力显微镜观察
目的:观察培养的人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和S91鼠黑素瘤细胞的形态结构.方法:培养并纯化来自正常人包皮的黑素细胞以及来自毛囊的无色素黑素细胞,同时复苏S91细胞株,传代后接种到内置云母片的培养板中,细胞贴附到云母片上后固定,用原子力显微镜扫描观察.结果:正常人表皮黑素细胞有3级分支,在主干及分支的顶端和侧缘可见膨出的球形结构.鼠黑素瘤细胞仅有很短的2级分支,在2级树突近端可见黑素小体.毛囊无色素黑素细胞只有1级树突,并只在树突近端有少数黑素小体.结论:表皮黑素细胞在形态上比黑素瘤细胞、毛囊无色素黑素细胞更成熟,有更多的黑素颗粒从树突的顶端和侧缘以胞吐的形式被输出.
