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重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子效价测定中佳细胞密度的探讨
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)效价的测定是采用TF-1rh GM-CSF依赖株细胞,该细胞的增殖与rh GM-CSF浓度成正比,用MTT法测定细胞增殖程度,反映rh GM-CSF的活性.在测定rh GM-CSF的效价过程中TF-1细胞的密度对实验结果有直接影响.
关键词： 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 TF-1细胞 密度 -
凋亡相关蛋白TFAR19在TF-1细胞凋亡中出现细胞核转位
目的：探讨凋亡相关分子TFAR19 在TF-1细胞凋亡过程中的表达及定位。方法：以TFAR19的单克隆抗体为工具，采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪等研究手段，观察细胞凋亡过程中TFAR19分子的表达水平和细胞内定位，分析其与细胞膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)以及细胞核DNA片段化的关系。结果：TFAR19蛋白在撤除GM-CSF的TF-1细胞中表达水平显著增高，伴有明显的核转位现象，且早于PS外翻和细胞DNA片段化。结论：TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一, 这一新发现为进一步探讨TFAR19蛋白的生物学效应，以及对细胞凋亡的多方位研究提供了新的线索和思路。
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神经生长因子依赖的TF-1亚克隆细胞株的筛选及应用
目的 筛选神经生长因子(nerve growth factor,NGF)依赖的TF-1亚克隆细胞株,用于重组人NGF(rhNGF)生物学活性的测定.方法 逐步将含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophagecolony stimulating factor,rhGM-CSF)的培养基替换为含鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)的培养基,将rhGM-CSF依赖的TF-1细胞驯化为mNGF依赖的TF-1细胞;绘制mNGF依赖的TF-1细胞的剂量-效应反应曲线,计算信噪比(S/N)和细胞大效应(maximal effect,Emax)区间;用甲基纤维素半固体培养基对mNGF依赖的TF-1细胞进行克隆化,镜下挑选单克隆细胞,扩大培养,绘制各单克隆细胞株对NGF的剂量-效应反应曲线,并对其中反应性好的单克隆细胞株进行STR图谱鉴定;对细胞接种密度和培养时间进行优化;用筛选出的细胞检测rhNGF的生物学活性.结果 经驯化,rhGM-CSF依赖的TF-1细胞可在只含mNGF的培养基中正常生长,并对NGF的刺激呈良好的剂量-效应反应关系;驯化后的mNGF依赖的TF-1细胞对mNGF的剂量-效应曲线的信噪比为2.0,Emax为0.43;共筛选出15株细胞形态良好、倍增时间稳定的单克隆细胞株,其中A2亚克隆细胞株(TF-1-A2)反应性好;该细胞中未发现人类细胞交叉污染现象,仅在CSF1PO位点与ATCC TF-1细胞数据有差异,可判定为TF-1细胞;细胞接种密度为5×104个/ml、培养时间为72 h时对rhNGF有良好的反应性,可用于rhNGF生物学活性的检测.结论 成功筛选出1株对NGF具有良好反应性的TF-1-A2亚克隆细胞株,可用于定量检测NGF的生物学活性.
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苦参碱对人急性红白血病细胞株TF-1 SALL4基因及Wnt/ β-catenin信号通路下游靶基因表达的影响
目的 探讨苦参碱对人急性红白血病细胞株TF-1 SALL4基因及Wnt/p-catenin信号通路下游靶基因表达的影响.方法 用不同浓度的苦参碱(0.5、1.0、2.0 g/L)处理TF-1细胞,另设对照组(不加苦参碱).苦参碱作用48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测各组TF-1细胞中SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因β-catenin、C-myc、Cyclin DI的表达水平,并分析SALL4基因与β-catenin、C-myc及Cyclin DI表达的相关性;Western blot法检测各组TF-1细胞中SALL4蛋白的表达水平.结果 经不同浓度苦参碱处理48 h后,TF-1细胞中SALL4、β-catenin、C-myc、Cyclin DI基因的表达水平及SALL4蛋白的表达水平与对照组相比,均明显下降,且呈浓度依赖性(P＜0.05);SALL4基因与p-catenin、C-myc、Cyclin DI基因的表达明显相关(rs值分别为0.912、0.818和0.832,P均＜0.o1).结论 苦参碱对TF-1细胞中SALL4基因和蛋白表达及Wnt/p-catenin信号通路下游靶基因β-catenin、C-myc、Cyclin DI的抑制可能在抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡过程中起重要作用.
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TF-1细胞饥饿在IL-4生物学活性测定中的应用
目的 研究细胞先饥饿后再用来测定生物学活性对实验灵敏度的影响.方法 用TF-1细胞/MTT比色法[2]测定重组人白细胞介素4(IL-4)的生物学活性,观察大吸光度与小吸光度之差,利用此差值就可以判断实验的灵敏度.结果 在测定结果中,适当的饥饿比没有饥饿的吸光度差值大.结论 用适当饥饿的细胞测定生物学活性灵敏度更高.
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GM-CSF/IL-3融合蛋白质量标准的研究和建立
目的:建立重组GM-CSF/IL-3融合蛋白的质控标准和检测方法,以用于该产品的常规质量控制.方法:用TF-1/MTT细胞增殖试验定量测定GM-CSF/IL-3融合蛋白体外生物学活性;用抗GM-CSF和IL-3的抗体分别进行WesternBlot进行鉴别试验;用C8-HPLC和SDS-PAGE测定蛋白纯度;用胰蛋白酶消化/C18-HPLC进行肽图分析;用顶空进样气相色谱法检测甲醇残留量;还原型SDS-PAGE测定融合蛋白相对分子质量;其他原液和成品检测项目参照2005年版中国药典三部的方法进行.结果:GM-CSF/IL-3融合蛋白的原液及成品与TF-1细胞的反应呈典型的S型曲线,符合四参数方程Y=(A-D)/[1+(x/C)^B)]+D,相关系数大于0.99,成品和原液的回收率均大于94%,RSD均小于20%;与GM-CSF和IL-3抗体进行的Westem Blot均为阳性;原液纯度大于95.0%;甲醇残留量小于0.005%,其他项目均符合2005年版中国药典三都要求.结论:建立的重组GM-CSF/IL-3融合蛋白质控标准和检测方法可以有效控制该制品的质量,并确保制品的安全与有效,已用于该制品的常规检定.
关键词： GM-CSF/IL-3 TF-1细胞 Westem blot 甲醇 -
浅谈TF-1细胞的培养、冻存和复苏技术
重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)的生物学活性检测中所需的TF-1细胞的生长依赖培养体系中GM-CSF的含量,通过检测TF-1细胞的增殖数,可定量测得GM-CSF的生物学活性.细胞冻存和复苏的基本原则是慢冻快融.
