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上海市黄浦区2013—2016年麻疹病毒分离株核蛋白基因特征分析
目的 分析上海市黄浦区2013—2016年麻疹病毒分离株核蛋白基因特征.方法 2013—2016年上海市黄浦区麻疹实验室共采集72例疑似麻疹病例咽拭子标本,用Vero/hSLAM细胞进行病毒分离,经real-time RT-PCR方法鉴定为阳性的麻疹病毒分离株,采用RT-PCR方法扩增麻疹病毒N基因核苷酸片段(450 bp),对扩增产物进行序列测定和基因特征分析.结果 72例疑似麻疹病例中分离到40株麻疹病毒.40例阳性病例中,男性23例(57.5％),女性17例(42.5％),年龄为(19.07±16.52)岁.40株麻疹病毒的基因亲缘关系显示,39株为H1基因型中的H1a基因亚型,并且有2个明显分支,另外1株为B3基因型.39株H1a基因型麻疹病毒株与同型参考株MVi/Hunan.CHN/0.93/7(AF045212)的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.8％～100.0％和96.6％～100.0％.结论 H1a基因亚型是上海市黄浦区2013—2016年本地麻疹流行的优势基因亚型,同一年份存在着不同的传播链.分离的病毒株在核苷酸和氨基酸序列水平上高度保守,关键功能位点未发生变异.
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三种丙型肝炎病毒核蛋白在人肝癌细胞的表达
目的用基因芯片分析丙型肝炎病毒(HCV)三种基因型HCV-1b、HCV-2a和HCV-4d核蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)的基因表达,重新认识HCV 核蛋白功能及其致病机制.方法建立表达HCV三种基因型核蛋白的Huh-7细胞系,提取总RNA制备探针,与Affymetrix人基因芯片HG-U133 杂交.对基因表达改变≥3或1.5倍的基因,通过Affymetrix网站用NetAffx进一步分析,并按生物学功能分类.结果 HCV-1b 核蛋白引起16个基因表达改变,其中免疫反应基因PF4V1和 SPP1分别上调3.4和4.4倍;HCV-2a 核蛋白对免疫反应基因CXCL5和凋亡基因BTF分别下调3.4和3.1倍,但对凋亡基因HRK、LZTS1则能上调3.2和3.4倍;与HCV-1b 和HCV-2a 核蛋白相比,HCV-4d 核蛋白可引起111个基因表达改变,对基因表达谱有更明显的影响.若设定基因表达改变≥1.5倍有意义,HCV-1b 和HCV-2a核蛋白可引起若干相同基因的改变.结论 HCV三种基因型核蛋白引起的基因表达谱各有特点,主要涉及免疫反应、凋亡、信号传导等基因,这对重新认识HCV 核蛋白功能及致病机制均有重要意义.
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2005—2010年贵州省狂犬病病毒与疫苗株核蛋白遗传差异分析
目的 分析2005-2010年贵州省狂犬病病毒(RABV)与疫苗株核蛋白基因的差异.方法 对贵州省不同地区2005-2010年收集的4份狂犬病患者标本和28份狂犬病病犬脑组织标本进行分析.采用直接免疫荧光法(DFA)和巢式RT-PCR检测,测定病毒N基因序列全长,同时,根据同源性及系统进化树比较,分析贵州省近年流行的RABV与GenBank数据库收录的RABV疫苗株N基因序列之间的差异.结果 经检测,21份病犬脑组织和4份患者标本RABV抗原和核酸阳性.经N基因序列测定拼接均得到长度为1353 bp的核苷酸序列.同源性分析显示,25株RABV毒株基因序列与GenBank数据库收录的RABV基因1型毒株的N基因核苷酸和氨基酸序列同源性较高,分别为89％ - 100％和98％～100％；与疫苗株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为86％～95％和96％～ 100％,在兽用疫苗株中,与HEP-Flury株N基因核苷酸和氨基酸的同源性高(分别为88％～89％和98％～99％),而在人用疫苗株中,与CTN株的核苷酸和氨基酸同源性高(分别为86％～100％和96％～100％).N基因系统进化树分析显示,25株毒株与RABV基因Ⅰ型毒株和疫苗株CTN株单独构成一群,与人用疫苗株CTN的差异小.结论 贵州省2005-2010年流行的RABV与兽用疫苗株HEP-Flury和人用疫苗株CTN在N基因水平的差异小.
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睾丸核蛋白表达和基因重排在上呼吸道睾丸核蛋白中线癌中的应用
目的 探讨睾丸核蛋白(NUT)抗体表达及基因重排在上呼吸道NUT中线癌(NMC)中的应用,以及NMC的发病情况、临床病理学特点、诊断及其鉴别诊断.方法 收集北京同仁医院病理科1990年至2010年诊断的上呼吸道小圆细胞型恶性肿瘤163例,包括低分化鳞状细胞癌(31例)及未分化癌(1例)、非角化型未分化鼻咽癌(60例)、小细胞神经内分泌癌(6例)及其他非上皮性小圆细胞型恶性肿瘤(65例).分析其临床特征及病理学特点,行EB病毒编码的小RNA探针(EBER)原位杂交检测及NUT单克隆抗体的免疫组织化学EnVision法染色.NUT抗体阳性表达的病例以荧光原位杂交(FISH)法检测NUT基因重排、以免疫组织化学染色方法标记角蛋白(AEI/AE3、CK7、CK8)、p63及神经内分泌标志物(神经元特异性烯醇化酶、突触素、嗜铬粒素A、S-100蛋白、CD56).结果 (1)3例低分化鳞状细胞癌及1例未分化癌中发现NUT抗体呈强阳性核表达,约占该组病例的12.5％ (4/32),占本组上皮性恶性肿瘤的4.1％ (4/98),全部病例的2.5％ (4/163)；其年龄范围为42～59岁；其他各组病例NUT抗体均为阴性；(2)4例NUT抗体阳性表达的病例其瘤细胞均表达角蛋白及p63,而神经内分泌标志物及EBER检测均阴性；(3)4例NUT阳性表达的病例中2例FISH检测证实有NUT基因重排,此2例患者死亡,另2例未检测到NUT基因重排,患者存活(分别为40及12个月).结论 (1)NMC是发生于上呼吸道的少见小圆细胞型恶性肿瘤,既往被归于低分化鳞状细胞癌及未分化癌中,其NUT抗体阳性表达及NUT基因重排阳性；(2)NMC好发于中线器官,特别是鼻腔鼻窦,与EB病毒感染无关,临床病程及预后有所不同；(3)NUT免疫组织化学染色及FISH检测在其诊断及鉴别诊断中发挥主要作用.
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吉林省2013年麻疹病毒核蛋白基因推导的氨基酸位点变异分析
目的 研究吉林省2013年麻疹病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)氨基酸位点的变异.方法 对吉林省2013年麻疹病例咽拭子标本用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NP基因片段,将麻疹病毒RT-PCR阳性产物进行测序,分析其NP基因推导的氨基酸序列变异情况.结果 吉林省2013年麻疹病毒均为H1a基因亚型.以吉林省2001年麻疹病毒NP基因推导的氨基酸序列为基准,2013年50份麻疹病毒RT-PCR阳性标本中有部分标本在4个氨基酸位点出现变异;在其中3个出现变异的氨基酸位点422位点(G→S)、457位点(S→G)、497位点(R→K)上,2001-2008年33株麻疹病毒中仅有个别毒株出现该3个位点的变异,而2009年、2010年、2013年在该3个位点发生如上变异的麻疹毒株所占比例分别为100％、76.9％以及32.0％ ～32.6％;在第430位点,仅2013年有44.0％的麻疹病毒阳性标本出现P→S的变异.结论 吉林省2013年麻疹病毒呈现NP的氨基酸位点变异多样化,提示要关注NP的氨基酸变异趋势.
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H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究
目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.
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一种狂犬病实验室诊断用单克隆抗体制备新路线的探索
目的 探索采用合成肽作为免疫原制备狂犬病实验室诊断用单克隆抗体的可行性.方法 以狂犬病病毒CVS-11核蛋白355-369位B细胞线性抗原表位合成肽与钥孔戚血蓝蛋白(Keyhole Limpe hemocyanin,KLH)大分子耦联后免疫BALB/c小鼠,利用经典杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体.采用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和间接荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)筛选和鉴定杂交瘤细胞株.结果 经过对杂交瘤细胞株上清的间接ELISA和IFA筛选获得阳性杂交瘤细胞株2B1D11,该杂交瘤细胞株产生的抗体经纯化后在IFA中可以有效检出感染犬脑组织和BHK-21细胞的狂犬病病毒.结论 采用合成肽作为免疫原制备狂犬病实验室诊断用抗体在技术上是可行的.
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甲型流感病毒核蛋白基因的克隆表达及纯化
目的将甲型流感病毒核蛋白(NP)基因克隆到原核表达载体进行可溶性融合表达,制备纯化的病毒核蛋白,为制备甲型流感病毒单克隆抗体提供材料.方法提取甲型流感病毒RNA,设计引物,RT-PCR扩增NP基因,利用基因工程的手段,将甲型流感病毒的NP基因在大肠埃希菌中进行融合表达,并将表达产物进行亲和层析.结果成功构建了甲型流感病毒NP基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物.结论通过合理控制发酵时间、生长温度和诱导物浓度,制备了较为理想的可溶性甲型流感病毒核蛋白.
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1995年大连麻疹病毒流行株的部分基因分析
目的 本实验以研究麻疹病毒(MV)为目的, 采用反转录聚合酶链式反应(RT PCR), 早期、快速、准确、灵敏地检出MV, 通过对扩增产物的基因分析, 判断传染源和传播途径, 并研究MV基因型.方法 对1995年6月大连地区发生的一起5人的麻疹流行进行MV检测, 用反转录套式PCR法分别扩增MV的核蛋白基因(N)和基质蛋白基因(M),阳性对照用长春冻干麻疹活疫苗.对疫苗株长-47(9405)和任意选取的两个标本DL1China95、DL2China95的扩增片段进行核酸序列测定,并对核酸序列、相应的氨基酸序列及基因差异进行计算机分析.结果 疫苗株和患者标本均扩增得到N基因318nt, M基因188nt核酸片段, 确证此次为麻疹流行.DL1China95、DL2China95有完全相同的核酸序列,属同一流行株,说明此次麻疹流行来自同一传染源,此结果与流行病调查结果相符.此流行株不同于疫苗株长-47(9405).M基因的152nt中,流行株5nt不同于疫苗株,其中有义突变2nt.N基因的变异较大,在282nt中,流行株有21nt不同于疫苗株,其中有义突变12nt.依据N基因1235～1516核酸序列, 此流行株的基因型分析结果与非洲、欧洲以及美国近年的流行株明显不同, 差别为(7.4～12.8)%.结论 MV的基因型分析有助于研究MV的流行规律,更好地进行疾病监测.
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肺癌中P53基因DNA水平突变与核蛋白的水平突变比较
目的研究肺癌P53基因DNA水平和蛋白水平的突变.方法应用PCR-SSCP银染技术检测了54例肺癌标本.结果 22例DNA水平突变阳性,突变率为41%.32例在核蛋白水平突变,突变率59%.其中22例DNA突变阳性者,核蛋白突变均阳性.而32例DNA水平突变阴性者,核蛋白突变阳性者9例,占28%.P53DNA突变与核蛋白的突变之间有显著相关性,并且两者都与患者的淋巴结转移有关(P＜0.01).结论 PCR-SSCP是一种高灵敏快速检测P53是否存在异常的有效方法.但是,P53突变阳性患者预后较差.
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α-synuclein片段对PC12细胞内蛋白聚集、线粒体功能和活性氧水平的影响
目的研究α-synuclein的纤维源性片段NAC对PC12细胞内蛋白聚集、线粒体功能及活性氧水平的影响.方法采用神经生长因子将PC12细胞诱导分化成多巴胺能细胞,后经不同浓度的NAC(0、0.1、1.0、10.0、25.0、50.0 μmol/L)处理48 h,MTT法测定线粒体氧化还原酶的活力.用硫磺素S染色观察细胞内蛋白聚集情况,JC-1检测线粒体膜电位,DCFH-DA检测细胞内活性氧水平.结果经NAC处理48 h后,与对照组比较,PC12细胞线粒体活力在高浓度(≥25 μmol/L)NAC作用时明显下降64.1%(P＜0.05).NAC(25 μmol/L)可诱导出现蛋白聚集,JC-1荧光染色可检测到线粒体膜电位明显去极化,DCFH-DA荧光染色及流式细胞仪检测显示PC12细胞内活性氧增加.60.6% 结论 NAC可引起PC12细胞内蛋白聚集,进而线粒体功能障碍及氧化应激增强,终导致细胞死亡.
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尿核基质蛋白22浓度与膀胱移行细胞癌病理分级分期关系的研究
目的探讨尿核基质蛋白22(NMP22)与膀胱移行细胞癌病理分级分期的关系.方法对1999年6月至2005年3月间就诊的642例膀胱癌患者行尿液NMP22检测,检测后1周～1个月内行膀胱镜和病理学检查,按病理分级分为3组,G1组为69例(男58例、女11例),G2组为375例(男255例、女120例),G3组为198例(男143例、女55例),比较中位数NMP22浓度.同时,对其中239例患者按病理分期分为3组,PT1组为121例(男76例、女45例),PT2组为65例(男37例、女28例),PT3组为53例(男36例、女17例),比较中位数NMP22浓度.结果G1、G2和G3组之间中位数NMP22浓度比较,差异有统计学意义(χ2=67.547,P＜0.001);PT1、PT2和PT3组之间中位数NMP22浓度比较,差异有统计学意义(χ2=20.629,P＜0.001).结论尿NMP22浓度与膀胱移行细胞癌的病理分级、分期有相关关系.
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新生儿Sotos综合征二例报道及文献复习
目的 探讨Sotos综合征新生儿临床表型和基因型的关系. 方法 2009年10月16日和2011年1月13日,2例新生儿分别收住复旦大学附属儿科医院,临床表现疑似Sotos综合征.分别应用基因芯片和多重连接依赖探针扩增技术进行基因检测,诊断为Sotos综合征.复习相关文献,分析基因型与临床表型的关系. 结果 (1)例l患儿出生时即表现为过度生长,出生体重及头围均大于同胎龄新生儿的第97百分位数;存在尖下颌、动脉导管未闭、阴茎短小、肾盂增宽、头颅MRI异常及低血糖.例2患儿出生时过度生长不明显,随访至45月龄时身高大于同龄儿童平均值的3个标准差;存在左肾积水、脑损伤、喂养困难和黄疸等.(2)基因检测结果显示,例1患儿5q35.2-5q35.3区域缺失1.97 Mb(175 496 385～177 466 774 bp),例2患儿5号染色体长臂NSD1基因区域缺失.2例患儿均确诊为NSD1基因缺失型的Sotos综合征. 结论 Sotos综合征表型与基因型具有相关性,基因检测有助于临床诊断.
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胰腺癌组织nm23-H1和PCNA的表达和其临床意义
目的:研究胰腺癌组织中 nm23-H1 和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达与生物学行为及预后之间的关系.方法:用免疫组织化学方法(SABC)对39例胰腺导管癌nm23-H1基因和PCNA的表达进行检测.结果:39例胰腺导管癌中nm23-H1基因蛋白的表达率为66.67%,PCNA平均增殖指数为27.5±16.4;nm23-H1的表达与组织学分级有关,P＜0.05,而与临床分期关系不大,P＞0.05;PCNA增殖指数与组织学分级和临床分期有关,P＜0.01;nm23-H1和PCNA与淋巴结转移呈正相关;nm23-H1的高表达与肿瘤细胞的高增殖状态有关,P＜0.01;nm23-Hl和PCNA的高表达均与患者的预后差密切相关,P＜0.05和P＜0.01.结论:nm23-H1和PCNA是反映胰腺癌生物学行为和预后的重要指标.
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PCNA和Ki67抗原与喉癌的相关性研究
目的:探讨增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67抗原表达与喉癌临床病理及预后的关系.方法:采用流式细胞免疫法检测40例喉鳞状细胞癌患者(声门上型13例,声门型27例)PCNA和 Ki67抗原表达,同时检测12例癌旁正常组织作为对照组.结果:癌组织与癌旁组织间PCNA和Ki67表达差异有极显著意义,P＜0.001;高、中分化鳞癌与低分化鳞癌间差异有极显著意义,P＜0.01;淋巴结转移阳性组与阴性组间差异有显著意义,P＜0.05;无复发生存组与复发、死亡组间差异有显著意义,P＜0.05;早期组(Ⅰ、Ⅱ)与晚期组(Ⅲ、Ⅳ)间差异无显著意义,P＞0.05.结论:PCNA和Ki67抗原表达与喉癌的病理分级和淋巴结转移呈显著正相关,与临床分期无关,两参数高表达是喉癌重要生物学特征.
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胃腺癌及淋巴结转移灶中上皮性钙黏素和p27与PCNA的表达及意义
目的:研究胃腺癌及其配对淋巴结转移灶中上皮性钙黏素(E-cd)、p 27蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及其意义.方法:应用免疫组织化学S-P法检测20例正常胃黏膜,20例不典型增生、109例胃腺癌原发灶及相应淋巴结转移灶中E-cd、p27和PCNA表达.结果:E-cd、p27和PCNA在不典型增生、胃腺癌原发灶及淋巴结转移灶中阳性表达率分别为85%(17/20)、40.37%(44/109)、23.85%(26/10 9)、60%(12/20)、33.03%(36/109)、19.27%(21/109)和25%(5/20)、74.31%(81/109)及77 .98%(85/109),三者之间差异有显著意义,P<0.01.E-cd和p27表达与胃腺Lauren分型、 TNM分期和预后显著相关.E-cd和p27的下降主要见于弥漫型胃癌,其在淋巴结转移灶中的表达明显低于原发灶.结论:E-cd、p27和PCNA可反映胃腺癌的生物学特性 ,是有价值的预后指标.
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核基质蛋白与膀胱癌相关性的初步研究
目的:探讨膀胱移行细胞癌核基质蛋白(nuclear matrix proteins,NMPs)与膀胱移行细胞癌的相关性.方法:根据Wen等的方法改良制备膀胱移行细胞癌NMPs;NMPs免疫家兔获得抗血清,利用免疫吸附法及硫酸铵沉淀法纯化抗血清;Western blot及confocal分析膀胱移行细胞癌NMPs与其他对照组之间的差异性.结果:膀胱癌NMPs具有(20～40)×103及(60～90)×103两富集蛋白条带区域,与对照组比较差异明显;膀胱移行细胞癌中NMPs主要表达于细胞核、核膜及部分胞质,而对照组织无明显特异性表达,差异有显著意义.结论:膀胱移行细胞癌存在肿瘤相关的特异性NMPs,为开发基于尿液或血液的免疫检测方法提供了实验基础.
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大肠癌组织p53、PCNA的定量检测与临床病理及预后的关系
目的:探讨p53蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)在结直肠癌细胞中的表达情况与临床病理及预后的关系.方法:应用自动化图像分析技术及SP法免疫组化,对53例大肠癌、30例大肠腺瘤及10例正常肠黏膜进行p53、PCNA的定量检测.结果:p53、PCNA阳性率分别为52.38%、97.73%.上述指标各参数值在正常肠黏膜→腺瘤→腺癌的顺序呈递变趋势,伴有淋巴结转移的腺癌组中,上述各参数值明显增高.p53与PCNA呈正相关,与组织分化程度无关.结论:定量检测p53、PCNA对判断大肠癌的恶性程度、预测其淋巴结转移趋势和预后有重要价值.
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异质性核糖核蛋白在肺癌诊断中的价值
选取肺癌、肺良性病变患者痰液标本180份(肺癌、肺良性病变各90例),经S液固定、DTT溶液解黏、涂片后,用ABC法以异质性核糖核蛋白(hnRNP A2/B1)抗体作细胞免疫组化染色,对比肺癌组与非癌组(良性肺病变)染色情况.另从我院同期确诊的肺癌患者中随机抽取90例,对比hnRNP A2/B1抗体检测与痰细胞学联合纤支镜活检、刷检诊断肺癌的阳性率.结果:hnRNP A2/B1在肺癌组阳性表达率为47.7%,特异性82.2%,与非癌组(17.8%)相比,差异有统计学意义,P＜0.005.与痰细胞病理学联合纤支镜活检、刷检阳性率(45%)相比,差异无统计学意义,P＞0.05.初步研究结果提示,hnRNP A2/B1在肺癌的诊断中有一定的参考价值,其阳性率接近于痰细胞学联合纤支镜活检、刷检的阳性率.
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乳腺癌患者T细胞亚群与Ag-NORs定量分析的临床意义
目的:探讨乳腺癌患者的免疫功能变化及临床意义.方法:采用单克隆抗体直接免疫荧光染色法及KI一型肿瘤免疫图像分析仪,对131例乳腺癌患者和37例正常对照组分别测定其外周血T细胞亚群、核仁银染区面积/细胞核面积比值(I.S%).结果:乳腺癌患者CD3、CD4、CD4/CD8比值,I.S%值比对照组明显降低(P<0.01);而CD20、CD8比对照组明显升高.结论:乳腺癌患者免疫功能低下;联合检测T细胞亚群与Ag-NORs可较全面反映乳腺癌患者的免疫功能状态.对了解病情、指导治疗有一定的作用.亦可用T淋巴细胞核仁区嗜银蛋白含量测定替代昂贵的T淋巴细胞亚群检测来评价轧腺癌患者的免疫功能状态.
