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BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞
目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性.方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中,诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞;在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定.结果光镜下,诱导后的细胞形态发生明显改变;RT-PCR结果表明,诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达,而没有Collagen Ⅲ的mRNA表达;诱导后98.39%的细胞呈CD44+、HLA-DR-.结论 BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞,间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一.
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人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建
目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源于细胞并表达蛋白.方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段.将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV.插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株.用PCR及多种酶切方法鉴定重组体.终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装.BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化.Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源于细胞后BMP12的蛋白表达.结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段.酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功.GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒.该重组病毒可成功感染脂肪来源组织于细胞并表达BMP12蛋白.结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究.
