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hTERT启动子调控TK基因靶向性杀伤鼻咽癌移植瘤的实验研究
目的 研究人端粒酶反转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统对鼻咽癌移植瘤的体内杀伤作用. 方法 采用培养细胞移植法,将人鼻咽癌细胞系C666-1接种于裸鼠腋部皮下,建立裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型.将40只裸鼠随机分为5组:hTERTp/HSV-TK/PGL3/GCV组、CMV/HSV-TK/PGL3/GCV组、HSV-TK/PGL3/GCV组、GCV组及生理盐水组,每组8只.采用脂质体介导,进行瘤内直接注射,同时经腹腔给予GCV治疗,观察各组裸鼠生存状况及肿瘤相对体积、抑瘤率,并进行荷瘤裸鼠肝肾组织的常规病理检查. 结果 成功构建了 C666-1裸鼠皮下移植瘤动物模型,hTERTp/HSV-TK/PGL3/GCV组移植瘤被明显抑制,抑瘤率达到45.51%,与HSV-TK/PGL3/GCV组、GCV组及生理盐水组(抑瘤率分别为5.52%、14.31%、0.03%)比较有显著性差异(P＜0.01),肝肾病理检查发现,该组裸鼠肝肾均无明显病理学变化.CMV/HSV-TK/PGL3/GCV组的抑瘤率亦达到51.56%,但病理检查发现裸鼠出现肝肾毒性. 结论 hTERT启动子调控TK基因靶向治疗系统能够在体内特异性杀伤鼻咽癌移植瘤,而无明显全身毒副作用,是一种安全、有效的肿瘤靶向基因治疗系统,将为鼻咽癌临床基因治疗开辟新领域.
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AdTK治疗肺癌的实验研究
目的:构建含HSV-TK基因的重组腺病毒AdTK,在两种肺癌细胞和鼠肺癌模型中对AdTK/GCV系统进行抑瘤实验研究.方法:采用同源重组法构建AdTK,用MTT法测定AdTK/GCV系统对H460、PG49人肺癌细胞的生长抑制率,建立T739鼠肺癌模型,观察AdTK/GCV系统对瘤体大小及鼠存活期的影响.结果:成功构建AdTK,AdTK转染H460、PG49细胞后对细胞抑制率随AdTK、GCV及药物作用时间的增加而增高,有显著性差异,小鼠体内实验中观察到AdTK/GCV系统对鼠肺癌有明显生长抑制作用,且明显延长了小鼠的存活期.结论:本文建立的AdTK/GCV系统在体内外对肺癌细胞均有明显抑制作用,为AdTK用于基因治疗奠定了基础.
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HSV-TK/ACV治疗小鼠肺腺癌LA795及其与机体免疫系统的关系
目的:探讨HSV-TK/ACV(GCV)系统对小鼠肺腺癌细胞LA795治疗作用及其与机体免疫系统的关系.方法:用重组逆转录病毒载体上清感染体外培养的小鼠肺腺癌细胞LA795,然后用新霉素类似物G418进行筛选,得到转染HSV-TK基因的LAtk细胞,分别将LA795细胞和LAtk细胞接种于小鼠皮下,观察ACV治疗后肿瘤生长情况、抗免疫功能以及对动物生存期的影响.结果:体外转染HSV-TK基因的LAtk细胞获得了对ACV的敏感性,接种LAtk细胞的治疗组动物在ACV治疗后出现了肿瘤体积缩小,而对照组接种LA795细胞的动物在ACV治疗后肿瘤体积逐渐增大,两者具有显著差异(P<0.01).治疗组动物生存期为51.8d,对照组动物生存期平均为15.9d,两者具有显著差异(P<0.01).光镜下观察治疗组肿瘤组织及血管周围有大量的淋巴细胞浸润,计数75个高倍视野中的淋巴细胞为116.03±52.95,而对照组为10.41±5.52,二者具有显著差异(P<0.01).超微结构观察显示淋巴细胞群攻击癌细胞现象,癌细胞出现凋亡征象.结论:①HSV-TK/ACV系统可以显著杀伤小鼠肺腺癌细胞LA795,使肿瘤消退,动物生存期延长,提示该系统有良好的治疗效果和应用前景.②HSV-TK/ACV系统治疗肿瘤除了其直接杀伤作用外,尚有机体免疫系统的参与.
关键词： HSV-TK基因 基因治疗 肿瘤浸润淋巴细胞 免疫 T739小鼠腺癌细胞 -
腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用
目的:观察HSV-tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用.方法:将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色,测定腺病毒的转染率.利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体AdCMVtk.AdCMVtk感染Hep-2细胞后,加入10 mg/LGCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应.结果:随着腺病毒感染复数量(multiplicity of infection,MOI)增加,对Hep-2细胞转染率亦增加,100%转染所需的MOI为200.AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系,即有浓度依赖性.此杀伤作用存在旁观者效应,但较弱.结论:腺病毒介导的HSV-tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用.
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腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用
目的:用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用.方法:利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响.结果:随着AdCMVLacZ的病毒量(MOI)增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%.AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞,且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用.AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡.结论:AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全.
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腺病毒载体介导的HSV-tk基因杀伤肿瘤细胞的研究
目的探讨HSV-tk基因对各种肿瘤细胞的杀伤作用及人、鼠瘤细胞对其敏感性及瘤细胞表面的αv整合素对腺病毒载体转染的影响.方法用同源重组法构建AdCMV tk基因;蚀斑形成法对重组腺病毒进行扩增、滴定;X-gal染色法观察腺病毒转染率,结晶紫染色法检测AdCMVtk/GCV的杀伤作用.结果 AdCMVtk对肿瘤细胞的杀伤强度在一定范围内与AdCMVtk的剂量呈正相关;对人类的Hela、GRC、Hep-2瘤细胞达100%转染所需的腺病毒感染复数量(multiplicity of infection,m.o.i)较鼠Lewis、BTT739瘤细胞的MOI量低;在相同MOI病毒量时,有αv整合素的瘤细胞转染率高于无αv整合素的瘤细胞.结论 AdCMVtk/GCV具有较明显的杀伤肿瘤细胞的作用,且有种属差异,对人瘤细胞作用大于鼠瘤细胞,瘤细胞表面的αv整合素有利于腺病毒的转染.
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HSV-tk基因/GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与缝隙连接关系的研究
目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因/丙氧鸟苷(GCV)系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接的关系.方法用PA317细胞包装STK质粒(逆转录病毒载体介导的HSV-tk基因),形成假逆转录病毒颗粒,转染有缝隙连接的大鼠胶质瘤细胞C6和无缝隙连接的人宫颈癌细胞Hela,制成C6 tk+和Hela tk+细胞,将不同比例的C6和C6 tk+、Hela和Hela tk+细胞混合,每种比例8孔,培养24h后4孔加入含0.5μg/ml GCV的培养基,4孔作对照,6d后用MTT法测量细胞存活率.在两个培养皿中放入周围粘有33mm高滤纸的载玻片,分别接种C6、C6 tk+细胞.细胞80%汇合后将载玻片互换,并加入含0.5μg/ml GCV的培养基,6d后观察细胞形态.结果 C6细胞组存在旁观者效应,Hela细胞组不存在旁观者效应.培养皿中tk+细胞大部分被杀死,tk-细胞无变化.结论 HSV-tk基因/GCV系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关.
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双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究
目的:构建高靶向性基因转移及表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:通过重组技术分别构建anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白表达载体ScFv-GALA-pET28a及含AFP启动子、GALA特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GALArec.IPTG诱导后,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GALArec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2,SMMC7721及A549.潮霉素筛选后,MTT法检测GCV对它们的杀伤作用.结果:双酶切鉴定、SDS-PAGE电泳及测序分别证明anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GALArec真核表达质粒构建成功.体外杀伤实验中,高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;不分泌AFP的A549/tk细胞则不敏感.结论:双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性.
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HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因对喉癌细胞Hep-2杀伤作用的体外研究
目的:观察自杀基因HSV-tk与不同细胞因子基因(IL-2、TNF-α)构建的不同融合基因表达产物对喉癌细胞系的体外杀伤作用.方法:分别构建不同融合基因逆转录表达载体PL(TI)SN,PL(T T)SN,PL(TK)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将各重组病毒分别感染人喉癌细胞系Hep-2,G418筛选出抗性克隆,分别命名为Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK,以RT-PCR及Southern blot检测各融合基因的整合及表达.通过观察各基因修饰细胞生长状况及GCV杀伤实验鉴定融合基因的表达及杀伤效应.结果:RT-PCR及South-em blot分析证明各重组外源基因在人喉癌细胞系Hep-2中均有整合及表达.Hep/TI,Hep/TK生长速度无明显差别,Hep/TT细胞增殖速度受到抑制.在GCV杀伤试验中,Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK均显示出对GCV的高敏感性,其中GCV对Hep/TT的杀伤作用为明显,各基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合,均显示出明显旁观者效应.结论:自杀基因与细胞因子基因共表达体系对喉癌细胞系Hep-2体外杀伤具有协同作用,并且有明显的旁观者效应,可望成为肿瘤基因治疗的新途径.
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重组腺病毒介导HSV-TK基因对胶质瘤细胞的生长抑制
本文构建了带有HSV-TK基因的腺病毒包装质粒pACCMVTK,并获得重组腺病毒AdCMVTK,用其感染胶质母细胞瘤细胞系TJ905,研究了HSV-TK/GCV系统对该细胞系的生长影响.结果发现该系统对胶质母细胞瘤细胞系TJ905生长有明显的抑制作用,以100 MOI(重复感染率)的病毒剂量感染细胞,GCV半数抑制浓度IC50仅为5 μmol,同时发现HSV-TK/GCV系统对TJ905细胞系有明显的旁观效应.表明该系统有治疗胶质瘤的应用前景.
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HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究
目的观察HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的旁观者效应并研究其作用机制.方法将转HSV-tk基因HTFs(HTFs-tk)与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合,加入5μg/ml更昔洛韦作用5 d,MTT法检测对HTFs的杀伤作用;染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)的能力;免疫细胞化学检测Cx43分布;RT-PCR及Western blot检测Cx43表达.结果旁观者效应随HTFs-tk/HTFs比例增加而增强,高细胞接种密度组明显强于低密度组;染料通过GJIC传输6级以上;Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达.结论旁观者效应需要细胞间密切接触,Cx43介导GJIC可能是HSV-TK/GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制,HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用.
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拓扑替康和更昔洛韦单独或联合应用对SKOV3/tk细胞生长的影响
目的:探讨更昔洛韦(GCV)与拓扑替康(TPT)单独或联合应用对携带有hTERT启动子调控的HSV-tk基因的SKOV3细胞生长的影响.方法:将hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组逆转录病毒载体成功转染人卵巢癌SKOV3细胞(SKOV3/tk细胞),用MTT法观察SKOV3/tk细胞对GCV、TPT的敏感性;观察合用GCV和TPT对SKOV3/tk细胞的杀伤作用.结果GCV及TPT对SKOV3/tk细胞的低有效浓度分别为10 mg/L和10 μg/L, 100 mg/L GCV与TPT合用时TPT对SKOV3/tk细胞的低有效浓度为5 μg/L.结论:GCV合用TPT较TPT单用更能抑制携带有HSV-tk基因的SKOV3细胞的增殖.
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hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察
目的:观察转染有人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性.方法:构建hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组逆转录病毒载体,筛选携带该载体的包装细胞,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞(SKOV3/tk细胞)并经RT-PCR方法鉴定.然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态,MTT法研究细胞生长特性,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力.结果:包装细胞产生的病毒滴度可达2×103 cfu·ml-1.SKOV3/tk细胞扩增出770 bp 的tk基因片段,形态与SKOV3细胞无明显差异;倍增时间72 h,无明显变化;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降.结论:hTERT调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体构建成功;转染细胞的裸鼠体内成瘤能力降低.
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乏氧射线双调控的TK腺病毒载体联合放疗抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长
目的 观察乏氧射线双调控的TK腺病毒载体-Ad HRE CArG.HSV-TK联合放疗对乳腺癌细胞Bcap37裸鼠移植瘤生长的影响.方法 皮下接种细胞于BALB/C(nu/nu)裸鼠建立移植瘤模型.当肿瘤直径达8～10mm时,将裸鼠分为对照组(control)、载体组(Ad)、照射组(RT)和载体合并照射组(Ad+RT).治疗开始为第1天,于第1、5天瘤内多点注射0.2ml表达载体,给药次日起腹腔注射GCV(40mg/kg),每日1次,连续14天.第2、4、6天给予2GyX线照射.每3天测量肿瘤长短径,计算肿瘤体积.治疗后30天处死裸鼠,剥离瘤块称重,计算抑瘤率.对肿瘤组织行HE染色和AnnexinV法检测凋亡.结果 实验组平均肿瘤体积和瘤重均显著小于对照组(P<0.05).HE染色可见肿瘤细胞变性坏死和凋亡细胞,AnnexinV检测显示实验组凋亡率明显高于对照组(P<0.05).结论 腺病毒载体联合放疗对Bcap37裸鼠移植瘤生长具显著抑制作用并可介导凋亡,为乳腺癌进一步的放射基因治疗研究奠定了基础.
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Hsv-tk、重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达
目的:构建pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体,观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达.方法:应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK-rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间,成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α,并在该载体转染人喉癌细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况.结果:酶切鉴定证实TK-rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间,并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK-rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达.结论:pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK-rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位,为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件.
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不同前药联合HSV-tk自杀基因系统对喉癌细胞体外杀伤效应的比较研究
目的观察并比较不同前药与自杀基因HSV-tk共同作用对喉癌细胞Hep-2的体外杀伤作用.方法构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒分别感染人喉癌细胞Hep-2,G418筛选出抗性克隆命名为Hep/tk,以RT-PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达.通过观察tk基因修饰细胞生长状况及比较不同前药对喉癌细胞杀伤效应以探讨不同前药作用机理.结果 RT-PCR及Southern blot分析证明tk基因在人喉癌细胞系Hep-2中有整合及表达;Hep/tk 与未转基因的原肿瘤细胞相比,二者生长速度及形态结构无明显差别;在不同前药敏感性试验中,Hep/tk显示出对GCV的高敏感性,而tk阳性和tk阴性细胞均显示对ACV和BVdU相对不敏感,tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗均显示出明显旁观者效应.结论人喉癌细胞系Hep-2对HSV-tk/GCV系统高度敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为喉癌基因治疗的新途径.
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Hsv-tk、重组人 IL-2、 TNF-α融合基因表达载体的构建与鉴定
目的：构建含有Hsv-tk、重组人IL-2(rhIL-2)、TNF-α(rhTNF-α)不同组合融合基因的逆转录病毒表达载体。方法：经分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总 RNA，以反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)制备人 IL-2 互补 DNA(complementary DNA,cDNA)模板。分别以 PCR方法扩增 3种基因，扩增产物纯化后克隆至测序载体 pGEM-T-Easy，挑取阳性克隆经鉴定后测序。将测序正确的各目的基因分别从测序载体相应酶切位点消化后，回收并纯化后与经相同双酶消化后的线性化 PLXSN表达载体连接，连接产物常规转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，经筛选后随机挑取阳性菌落后，提取质粒酶切鉴定插入片段大小和位置以获得正确重组子。按上述定向克隆方法依次将各片段正向插入至 PLXSN表达载体的多克隆位点间，以构建含不同融合基因的真核表达载体。结果：经限制性酶切分析及 PCR方法鉴定，各插入基因及融合基因大小、位置、方向均正确无误。结论：Hsv-tk、IL-2、TNF-α不同组合融合基因表达载体的成功构建为喉癌的基因治疗提供部分实验基础 ,也为表达具有多功能活性的新型融合蛋白和发现细胞因子的新功能提供有利条件。
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HSV-tk/GCV系统对鼠膀胱癌的自杀基因治疗研究
目的:在体外和体内水平建立膀胱癌的单纯疱疹病毒-胸苷激酶/丙氧鸟苷(herpes simplex virus type thymidine Kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统,并验证该系统的有效性.方法:用逆转录病毒载体HSV-TK转染鼠膀胱癌细胞株T739,体外检测其对GCV的敏感性,在同基因鼠,分别建立T739和T739-TK膀胱癌腹腔肿瘤模型.当B超显示肿瘤直径约0.5～0.8cm时,腹腔GCV给药6天,然后观察肿瘤大小变化及动物存活时间.结果:GCV对T739-TK细胞有显著杀伤作用,而对T739细胞的生长无影响,成功的建立了T739同基因鼠膀胱癌腹腔肿瘤模型,体内实验得到相应结果,转染了TK基因的T739鼠肿瘤明显变小,甚至消失,而未转染TK基因的T739鼠肿瘤继续增大,GCV对其无明显治疗作用,转染了TK基因的T739鼠存活时间显著延长.结论:在体外和体内水平,表达TK基因的肿瘤细胞均被GCV有效杀伤,这表明HSV-tk/GCV系统有可能成为基因治疗膀胱癌的有效方法.
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HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究
目的为探讨HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应.方法台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739-TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究.结果 HSV-TK/GCV系统有效的杀伤T739-TK细胞,且这种作用有明显的旁观者效应,旁观者效应的强弱与T739-TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关.结论 HSV-TK/GCV系统不仅能有效的杀伤T739-TK细胞,而且对T739细胞有明显的旁观者效应.
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泌尿系统肿瘤HSV-TK基因治疗的研究进展
目前肿瘤的基因治疗越来越成为肿瘤防治研究中的一个活跃领域,HSV-TK基因是典型的自杀基因,现在该基因已被广泛应用于各种肿瘤治疗研究,美国等国家正式批准该基因进入临床治疗肿瘤,包括脑胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌等,其他如肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等也正在研究中.本文就近年来该基因在泌尿系统肿瘤中的应用进展作一简介.
