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双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究
目的:构建高靶向性基因转移及表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:通过重组技术分别构建anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白表达载体ScFv-GALA-pET28a及含AFP启动子、GALA特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GALArec.IPTG诱导后,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GALArec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2,SMMC7721及A549.潮霉素筛选后,MTT法检测GCV对它们的杀伤作用.结果:双酶切鉴定、SDS-PAGE电泳及测序分别证明anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GALArec真核表达质粒构建成功.体外杀伤实验中,高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;不分泌AFP的A549/tk细胞则不敏感.结论:双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性.
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受体介导内吞对巨噬细胞膜电位、胞浆和溶酶体pH的影响
本文利用荧光标记方法测量了刀豆素A、麦芽凝集素、酵母多糖刺激引起的巨噬细胞膜电位、胞浆pH、溶酶体pH的变化.结果显示三种配体均导致细胞膜电位超极化,胞浆pH降低,溶酶体pH升高,三个生理参量趋于稳定时间稍有不同.胞浆pH的降低可能有抑制内吞的作用,溶酶体pH上升是触发溶酶体内容物外排的基本因素.内吞引起的这些变化是细胞代谢过程中自我调节和保护的表现.
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受体介导内吞和自噬同凋亡的关系
目的观察刀豆素A(ConA)与小鼠腹腔巨噬细胞表面ConA受体结合、内吞、转运及巨噬细胞自噬、凋亡的形态学变化,以探讨受体介导内吞与自噬体形成和细胞凋亡之间的关系.方法用辣根过氧化物酶(HRP)标记ConA(ConA-HRP)与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育,不同时间取出部分巨噬细胞,制备电镜标本,观察.结果透射电镜观察表明:ConA的内吞属于受体介导内吞;形成的内吞体有泡状、管状及双层膜的线状等形式;双层膜的线状结构包裹部分胞质和细胞器,形成自噬体;自噬体与溶酶体融合,而后巨噬细胞凋亡.结论受体介导内吞和自噬同凋亡之间存在一定的关系.
