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噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证
目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证.方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白.然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性.后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性.结果通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLS表达量占菌体总量的30%.同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos.经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6 TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化.结论成功地获得了具有内切酶活性的H6 TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础.
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铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位DNA结合能力的测定
目的 检测铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位与噬菌体基因组末端cos位点的结合能力.方法 通过PCR扩增出末端酶大亚单位编码基因tls,经pMD-T18载体克隆至表达载体pQE31上,IPTG诱导表达,获得包涵体蛋白,用包涵体裂解液溶解包涵体,通过Ni-NTA亲和层析,分离出重组目的蛋白rTLS,透析复性后,与生物素标记的基因组末端cos片段进行结合反应,通过EMSA检测DNA滞后现象.结果 成功构建了表达载体pQE-tls,获得了纯化的具有生物学活性的重组末端酶大亚单位rTLS,EMSA结果证实结合rTLS后的cos片段与无蛋白加入的对照组相比明显滞后.结论 重组噬菌体PaP3末端酶大亚单位在体外可与基因组末端cos片段发生特异性结合,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
