首页 > 文献资料
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究
应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因.以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(一)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(一)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.文库扩增后得到121个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到115个200～1 000bp的插入片段,对其中的90个片段测序,并进行同源性分析,显示31种已知基因编码蛋白和15种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5A反式激活靶基因.结果提示,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究
目的应用微矩阵(microarray)技术,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因,阐明慢性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的等相关疾病的发病机制.方法根据HCV-H病毒株序列设汁、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,获得的HCV NS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcD-NA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP13,在GenBank中登录,登录号为D21262.NS5ATP13基因的编码序列全长为2103个核苷酸(nt),编码产物由700个氨基酸残基(aa)组成.结论丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反式激活作用.微矩阵技术是分析基因表达谱变化的自动化和高通量技术.应用这些技术,发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,将为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制及HCV相关疾病发病机制奠定基础.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白HS5A反式激活基因HS5ATP6的克隆化研究
目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因.方法以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的KOZ2ak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.结果从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP6,在GenBank中注册,注册号为AF529367.NS5ATP6基因的编码序列全长为1572个核苷酸(nt),编码产物由524个氨基酸残基(aa)组成.结论HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP6的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究
目的为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用基因芯片技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,获得的HCV NS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果构建了真核表达载体pcD-NA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以PCDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP11,新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt),编码产物由418个氨基酸残基(aa).结论HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究
目的筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因,研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制.方法应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术,以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册,注册号为AF529370.结果NS5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt),编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成,并成功的克隆化.结论HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向.
