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胰腺癌细胞株中NPTX2基因的甲基化情况研究
目的 探讨神经元正五聚蛋白2(NPTX2)基因在胰腺癌中低表达的分子机制.方法 利用甲基化特异性PCR(MSP)方法 检测2例正常胰腺组织及ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、PANC-1、SW1990 等6株胰腺癌细胞株中NFFX2基因的甲基化情况,并对产物进行测序验证.利用DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-za-dC)处理细胞株ASPC1 及 PANC1,再运用qRT-PCR及SYBR Green荧光掺人甲基化特异性定量PCR法检测NPTX2基凶的mRNA水平及甲基化程度.结果 MSP结果 显示正常胰腺组织中NPTX2基因未发生甲基化,而在6株胰腺癌细胞株中NPTX2基因均有不同程度的甲基化.胰腺癌细胞株ASPC1及PANC-1在5-Aza-dC处理前的甲基化指数(MI)分别为0.964、0.472,mRNA表达的相对值(RQ)分别为5.251和0,而处理后的MI分别为0.531、0.226,RQ分别为5.965和1.076.结论 NPTX2基因启动子的高甲基化是该基因在胰腺癌中表达下降的主要原因之一.
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人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化
目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.
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NPTX2基因甲基化与年龄推断的相关性研究
目的:探讨神经元正五聚蛋白2(neuronal pentraxin Ⅱ,NPTX2)基因启动子区CpG位点甲基化与年龄的关系.方法:提取170例活体外周血样本的基因组DNA,经甲基化修饰试剂盒修饰后,利用甲基化特异性-PCR(methylation specific-PCR,MSP)检测其NPTX2基因启动子区甲基化情况,并分析其与性别、年龄的关系.结果:以每个样本年龄、性别为自变量,是否甲基化为因变量,用二分类的logistic回归分析显示,是否甲基化与性别因素不具有统计学意义(P=0.843),表明性别因素对NPTX2基因甲基化影响不明显;而是否甲基化与年龄因素则具有统计学意义(P=0.000),表明年龄因素显著影响该基因的甲基化.以五岁为一个年龄段,对其定性情况进行线性回归分析显示男性(P=0.001)、女性(P=0.000)、总体(P=0.000)均存在线性关系,表明甲基化率是随年龄段的增加而呈线性增长的.结论:NPTX2基因启动子区甲基化程度随年龄的增加而增加.可进一步研究建立回归模型,进行年龄推断.
关键词： 神经元正五聚蛋白2 年龄推断 甲基化 甲基化特异性-PCR
