首页 > 文献资料
-
人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选
目的:PC-1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C4-2中高表达.为了进一步研究PC-1基因的功能及作用机制,构建C4-2细胞的Cdna文库,寻找与前列腺癌相关基因PC-1相互作用的蛋白.方法:从前列腺癌细胞系C4-2中提取总RNA,进而分离poly(A) + RNA,用poly(A)+ RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(Dt)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组.通过文库片段、线性化的Pgadt7-Rec和诱饵质粒Pgbkt7-PC-1-C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC-1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的Pgadt7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选.后用Far-Western印迹方法进一步从体外论证了PC-1蛋白可与自身相互作用形成二聚体.结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌Cdna文库,双链Cdna片段的长度大小范围为250～5 000 bp.共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105.接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106.筛选到4个与PC-1蛋白相互作用的阳性克隆.从体外证明了PC-1蛋白可形成二聚体.结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求.可用于前列腺癌相关基因的进一步筛选,已筛选得到的蛋白尚需进一步鉴定.
-
PG-1基因表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响
背景与目的:PC-1基因在雄激素非依赖和高转移能力的前列腺癌C4-2细胞中高表达,在雄激素依赖及不转移的前列腺癌LNCaP细胞中低表达.本实验旨在研究PC-1对前列腺癌细胞迁移能力的影响.方法:构建PC-1稳定高表达的LNCaP细胞株和反义核酸调低内源性PC-1表达的C4-2细胞株.利用体外迁移系统检测PC-1表达对LNCaP和C4-2细胞迁移运动能力的影响.结果:体外迁移实验表明稳定转染提高PC-1的表达水平并未使LNCaP迁移细胞数增多(P>0.05),而反义核酸降低PC-1表达则使C4-2迁移细胞数降低(P<0.05).PC-1蛋白水平升高不能提高LNCaP细胞迁移能力,但降低内源性PC-1表达则使C4-2细胞迁移能力明显降低.结论:PC-1可能在前列腺癌细胞侵袭过程中起一定作用.
-
应用基因芯片技术筛选前列腺癌雄激素去势抵抗相关的基因
目的 利用基因芯片技术高通量筛选前列腺癌雄激素去势抵抗相关的基因,为研究雄激素去势抵抗进展及前列腺癌的分子机制奠定基础.方法 提取并纯化LNCaP及C4-2细胞的总mRNA,反转录合成荧光分子标记的cDNA,与基因芯片杂交;采用Genepix Pro6.0图像分析软件分析,筛选表达差异的基因;KEGG富集分析每个pathway中差异基因富集的显著性.结果 在表达谱芯片中筛选出417个差异表达的基因,包括301个C4-2细胞中表达上调的基因,116个表达下调的基因;KEGG富集分析显示与前列腺癌相关表达差异的基因有GF、EGFR、HSP、BAD、P21、E2F、Raf、CyclinE、PSA、PI3K等,其中EGFR、Raf、PSA表达差异明显.结论 EGFR、Raf、PSA基因的表达异常可能在雄激素去势抵抗型前列腺癌的形成过程中发挥着重要的作用,本研究为前列腺癌去势抵抗进展的分子机制的探索提供了理论依据.
-
基因芯片筛选LNCaP与C4-2细胞中P53信号通路相关差异表达基因
目的 运用基因芯片筛选雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP与雄激素非依赖性前列腺癌细胞系C4-2中p53信号通路相关差异表达基因,寻找去势抵抗性前列腺癌的可能发生机制.方法 体外培养前列腺癌细胞系LN-CaP和C4-2,TRIzol试剂提取两种细胞的总RNA并纯化,按Agilent芯片说明对总RNA进行杂交,所得荧光信号采用Aligent Scanner、Imagene和Genespring软件进行分析和显示.结果 以LNCaP为对照,C4-2细胞中3组均表达差异的基因共417个,上调基因301个,下调基因116个.KEGG转录域覆盖率分析显示,差异表达基因中与p53信号通路相关的占9.3％;p53信号通路中表达差异的基因分别为ATR、p21、CDK4/6、CyclinE、Gadd45、PIGs、CytC、IGF-BP3、TSP1、p53R2、Sestrins和CyclinG,其中p21、CDK4/6、CyclinE的表达差异显著.结论 筛选出在LNCaP和C4-2细胞系p53信号通路中差异表达基因12个,其中p21、CDK4/6、CyclinE可能参与了CRPC的发生发展,为进一步研究前列腺癌的进展机制奠定了基础.
-
基因芯片分析前列腺癌细胞系中转移相关基因
目的:通过基因芯片技术检测具有不同转移潜能的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中表达差异的基因,寻找前列腺癌转移相关基因.方法:采用TRIzol一步法提取LNCaP和C4-2细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子标记的cDNA探针,与基因芯片杂交.采用Genepix Pro 6.0图像分析软件进行芯片图像分析,把图像信号转化为数字信号,然后以差异大于等于2倍的标准来确定差异表达基因.结果:在LNCaP与C4-2细胞中,表达差异的基因共有417个,上调基因301个,下调基因116个.分析显示差异表达基因分别与细胞增殖、代谢、细胞因子、细胞转移等相关,其中发现7个基因与肿瘤细胞的转移相关,分别为EGFR、EGF、PIK3R1、Cyclin E、HYAL1、GNAI1、AZGP1.结论:筛选出LNCaP与C4-2细胞系中7个转移相关基因,为进一步研究前列腺癌转移机制奠定了基础.
