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用Red重组系统快速敲除大肠杆菌aroL和aroK基因
目的:利用Red重组系统构建aroL和aroK缺失的大肠杆菌工程菌株.方法:本研究应用PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化大肠杆菌BW25113.在阿拉伯糖诱导下,含有质粒pKD46的菌株DH5α表达λ噬菌体的3个重组蛋白,利用含同源臂的氯霉素抗性片段分别替换目的基因aroK和aroL,并进一步利用FTP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.结果:成功地敲除了aroK和aroL基因.结论:莽草酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体,具有广泛的医药、化工应用价值.莽草酸是莽草酸途径中的重要中间产物,它在莽草酸激酶(aroK和aroL)的作用下流向3-磷酸莽草酸,阻碍了莽草酸在大肠杆菌体内的堆积.敲除上述基因将为使用大肠杆菌发酵生产莽草酸奠定基础.
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以莽草酸激酶为靶点的新型抗结核先导化合物的发现
莽草酸激酶是莽草酸途径中的关键蛋白,对结核分枝杆菌的生存至关重要.本研究首先建立了结核分枝杆菌莽草酸激酶 (Mycobacterium tuberculosis shikimate kinase, MtSK)抑制剂筛选模型,然后与耻垢分枝杆菌表型筛选方法联用,对12万个化合物进行筛选,终发现了1个对MtSK蛋白有抑制作用且同时抑制耻垢分枝杆菌生长的化合物—IMB-T5297 [(E)-3-(3-(3-氯-5-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙烯酰基)-6-甲基-2H-吡喃-2,4(3H)-二酮].体外酶促反应抑制实验表明,化合物IMB-T5297对MtSK的半数抑菌浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为1.745 μg·mL-1.表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)实验结果显示化合物 IMB-T5297与MtSK蛋白的亲和力KD值为2.151×10-5 mol·L-1.通过计算机软件模拟化合物与蛋白的分子对接模型,初步分析了化合物IMB-T5297与MtSK的作用位点,并对其中预测的5个关键氨基酸位点进行了突变研究.3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]实验表明,化合物IMB-T5297对哺乳动物细胞的毒性很低.体外抗结核活性实验表明,化合物IMB-T5297对结核分枝杆菌标准株H37Rv低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为49.723 μg·mL-1.综上所述,虽然化合物IMB-T5297的抗结核活性较弱,但对MtSK抑制作用较强,通过结构改造可能成为新的抗结核先导化合物.
