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人工转录因子的研究进展
人工转录因子是通过模拟天然转录因子的结构,由人为设计的DNA结合结构域和功能结构域组成.人工转录因子的构建包括DNA结合结构域和功能结构域的构建,通过体外设计筛选或模建,然后进入体内与特异DNA序列结合调控目的基因的表达;目前有关人工转录因子的应用研究主要集中在人类疾病的治疗,药物发现和生产,农业生物技术及基因功能的研究等方面.
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一种可特异识别Hmox1增强子的人工转录因子的构建
目的:设计一种可特异识别人血红素加氧酶-1基因(Hmox1)增强子的人工转录因子.方法:以锌指蛋白(ZFP)作为人工转录因子的DNA结合结构域,在人Hmox1增强子上选择一段序列作为锌指蛋白靶序列,提交Zinc finger tools 3.0设计得到该锌指蛋白的氨基酸序列,通过Swiss Model同源建模,对设计结果进行分析;将锌指蛋白与效应结构域相连组成完整的人工转录因子,用双荧光素酶报告基因检测系统检测其活性.结果:得到了能特异识别人Hmox1增强子的锌指蛋白氨基酸序列,同源建模结果显示其空间结构稳定,所构建的完整人工转录因子经双荧光素酶报告基因检测系统检测能特异上调报告基因的表达.结论:设计得到的人工转录因子经实验验证能特异识别人Hmox1增强子并有效上调报告基因的表达,为进一步构建可上调细胞核内Hmox1表达的人工转录因子奠定了基础.
关键词： Hmox1 人工转录因子 锌指蛋白 同源建模 双荧光素酶报告基因检测 -
GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究
目的 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有上游激活序列(UAS)启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体组成的GAL4/VP16-UAS系统,观察融合转录因子GAL4/VP16的活性.方法 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA3-GAL4/VP16,含有5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因核心启动子的人工杂合启动子驱动报告基因EGFP的表达载体pGL3-G5E1b-TATA-EGFP,利用脂质体将两种载体瞬时转染Hep3B和HEK293细胞,48 h后采用RT-PCR和流式细胞术检测EGFP的表达,观察GAL4/VP16融合转录因子对G5E1B-TATA的转录调节作用.结果 在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下,G5E1b-TATA启动子活性明显上调,甚至可以达到巨细胞病毒(CMV)启动子的活性程度.结论 GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用,并且该转录活性足以达到驱动下游目的基因高效表达的水平,在基因治疗和基因功能的研究中具有一定的应用潜力.
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HBV人工转录因子的制备及其靶向抑制HBV增强子活性研究
目的 构建可靶向性识别HBV增强子的锌指蛋白人工转录因子真核表达载体,检测其在真核细胞内的表达、对细胞增殖影响及生物学活性分析.方法 应用锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)设计工具Zinc finger tools 3.0获取人工转录因子(artificial transcription factor,ATF)结合结构域并融合抑制性效应结构域KRAB,全基因合成ATF克隆进真核表达载pcDNA3.1(+),酶切、测序来鉴定构建载体的正确性,X-tremeGENE HP转染pcDNA3.1-ATF于HepG2细胞,采用RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测ATF mRNA与蛋白的表达情况;CCK-8检测不同浓度的ATF表达载体转染后对细胞增殖的影响;双荧光素酶报告基因检测ATF对HBV增强子序列的靶向性抑制作用.结果 成功构建pcDNA3.1-ATF真核表达载体;在HepG2细胞中能够正常表达;CCK-8检测ATF对细胞增殖生长无明显的毒性作用;双荧光素酶报告基因分析ATF能靶向性结合增强子并抑制报告基因的表达.结论 通过基因工程的方法构建pcDNA3.1-ATF的真核表达载体可正常表达且无明显细胞毒性作用,可靶向性识别HBV增强子并具有相应的生物学活性.
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HBV人工转录因子与拉米夫定抗HBV作用的比较研究
目的 构建特异性结合乙型肝炎病毒X基因启动子(Hepatitis Bvirus X promoter,HBV Xp)的人工转录因子真核表达载体,并与拉米夫定(3TC)体外抗乙肝病毒效果进行比较研究.方法 利用Zine finger tools 3.0软件设计特异性结合HBV Xp的锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)并融合抑制性效应结构域kRAB,全基因合成后载入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)-nls-ZFP-kRAB-Flag (ATF)、pcDNA3.1(+)-nls-ZFP-Flag(ZFP1)、pcDNA3.1(+)-nls-kRAB-Flag(ZFP2),通过酶切、测序鉴定重组质粒的正确性,Western blot和细胞免疫荧光鉴定重组质粒在HepG2细胞表达情况.将重组质粒转染HepG2.2.15细胞,设空白组(Blank组)、ATF组、ZFP1组、ZFP2组、空质粒组(Emptyvector组)和拉米夫定组(3TC组),分别培养2、6、10 d,用Western blot、FQ-PCR、ELISA分别检测各组HBx蛋白、HBVDNA、上清中HBsAg和HBeAg的表达情况.结果 重组质粒成功构建且能在HepG2细胞中表达;ATF组抑制HepG2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达,与其余各组相比差异有统计学意义(P＜0.05),且6d和10 d抑制作用强于2 d;3TC组亦能抑制HepG2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达(P＜0.05).ATF组能抑制上清中HBsAg,HBeAg的分泌,与其余各组相比差异有统计学意义(P ＜0.05);3TC组亦能抑制上清中HBsAg,HBeAg的分泌(P＜0.05).结论 人工设计的特异性ATF在真核细胞中能正常表达,并能有效发挥抑制HBV的作用,且抑制作用强于拉米夫定.
关键词： 锌指蛋白 人工转录因子 乙型肝炎病毒 X蛋白 HepG2.2.15细胞 -
A20人工锌指转录因子真核载体的构建及其对内皮细胞炎症反应的影响
目的 观察A20基因的人工锌指转录因子(zinc finger-artificial transcription factor,ZF-ATF)对内源性A20基因及内皮细胞炎症反应的影响.方法 根据人A20基因的序列,设计出其ZF-ATF,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,与通过BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体,质粒转化感受态细菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,限制性内切酶酶切鉴定,鉴定阳性克隆进行测序.质粒DNA转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),通过Western blot检测A20蛋白的表达,用脂多糖(LPS)诱导HUVEC细胞产生炎症反应,利用Western blot检测NF-κB p65的表达情况,利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等的水平.结果限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成的含ATF的真核载体寡核苷酸链插入正确,Western blot证实转染HUVEC后A20蛋白表达显著增加.ELISA法检测结果表明,在LPS刺激后,空载体组及空白组细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α表达均明显上调,而ZF-ATF转染组没有明显上调,与空载体组及空白组比较,有统计学差异(P＜0.05,P＜0.01)；Western blot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κB p65的表达(19.8±4.5)较空载体组(90.2±5.9)及空白组(96.3±3.3)显著下调(P＜0.01).结论 成功构建人工锌指转录因子真核表达载体,且能够启动内源性A20的稳定表达,并发挥其抗炎等作用.
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应用人工转录因子技术抑制乙型肝炎病毒复制
目的 设计与构建特异性结合乙型肝炎病毒增强子1(HBV Enh1)的锌指蛋白人工转录因子(ZFP-ATF),检测在HepG2.2.15细胞内的表达、对细胞生长影响及观察其抑制HBV DNA复制与表达的作用.方法 构建含结合结构域ZFP与抑制性效应结构域Krüppel相关盒(KRAB)的人工转录因子(ATF),进行相关修饰、优化后,将人工合成ATF核酸序列插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),测序鉴定其正确性,X-tremeGENEHP转染HepG2.2.15细胞,共聚焦显微镜下观察ATF蛋白表达情况,CCK-8法检测ATF对细胞生长的影响,ATF转染24、48、72 h后,采用实时定量PCR、ELISA、Western blot法检测对HBV DNA复制与表达的抑制作用.结果 成功构建pcDNA3.1-ATF(nls-ZFP-KRAB-FLAG)真核表达载体,ATF在HepG2.2.15细胞中能正常表达,且对细胞生长无明显的影响,ATF具有抑制HBV DNA复制与表达的作用,在转染72 h后抑制作用达高,抑制率达68.0％.结论 构建的ATF在HepG2.2.15细胞中能够正常表达且无毒性作用,可特异性结合HBV Enh1靶序列并具有抑制HBV DNA复制与表达的作用.
