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基于分子对接技术虚拟筛选菊苣与肠道CNT2结合的化学成分研究
利用分子对接技术虚拟筛选菊苣与肠道浓度型核苷转运蛋白2(CNT2)结合的化学成分,为探讨菊苣干预嘌呤核苷吸收的降尿酸作用机制研究提供理论依据.采用同源建模手段构建人CNT2三维结构模型,采用Vina软件虚拟筛选菊苣小分子化合物作用于CNT2的化学成分.以CNT2抑制剂7,8,3'-三羟基黄酮的打分为阈值,筛选出23个打分高于阳性抑制剂的菊苣化学成分.其中打分靠前的菊苣化合物是菊苣降尿酸作用的重要化合物,其能否通过抑制CNT2活性干预肠道嘌呤核苷的吸收降低体内尿酸水平有待生物学实验进一步探讨.CNT2可能是菊苣降尿酸的效用靶点,为指导实验研究菊苣干预嘌呤核苷吸收降尿酸研究提供向导.
关键词： 同源建模 富集型核苷转运蛋白2 菊苣 虚拟筛选 高尿酸血症 -
南宁分离株A(H3N2)流感病毒神经氨酸酶遗传变异及蛋白结构分析
目的 应用生物信息学方法分析南宁市2007-2012年A(H3N2)亚型流感病毒分离株神经氨酸酶NA的遗传变异规律、二硫键、酶活性中心位点、抗原决定簇位点、糖基化位点及蛋白结构变化情况. 方法 通过RT PCR扩增H3N2病毒NA基因并测序,运用生物软件对所测序列进行拼接和同源比对;通过构建系统进化树分析进化规律,通过同源建模分析蛋白结构的变化. 结果 系统进化树将40株NA基因序列分为4个类群,呈多侧支流行;毒株的二硫键高度保守,酶活性中心位点224和位点276出现氨基酸的替换,部分毒株NA抗原决定簇328、332、336、434氨基酸位点发生替换;所有毒株200、329和402糖基化位点全部丢失,部分毒株在367位点增加一个糖基化位点,在234位点丢失一个糖基化位点;HA晶体结构分析氨基酸突变位点主要发生在β折叠部位和无规则卷曲部位. 结论 南宁分离株A(H3N2)亚型流感病毒变异活跃,抗原决定簇位点、酶活性中心位点、糖基化位点均出现氨基酸的替换.因此应继续加强对南宁市的流感监测,及时了解当地流感的流行趋势和病毒的抗原变异情况,为全国的流感预防、控制、预测及流感疫苗株的开发提供理论依据.
关键词： A(H3N2)亚型流感病毒 神经氨酸酶 遗传变异 蛋白结构 同源建模 -
2013-2014年南宁市A(H3N2)亚型流感病毒病原学特征分析
目的 分析南宁市2013-2014年A(H3N2)亚型流感病毒的病原学特征及流行趋势. 方法 通过RT-PCR扩增毒株A(H3N2)病毒血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)并进行同源比对,采用Mega5.1(N-J法)构建系统进化树,统计氨基酸位点的差异,同源建模后分析蛋白结构的变化. 结果 构建系统进化树,20株毒株HA基因与NA基因均分为4个类群,呈多侧支流行;部分毒株的HA蛋白A抗原决定簇144位点及B抗原决定簇156和158位点发生突变,二硫键和糖基化位点高度保守,未发生变化;NA蛋白抗原基本稳定,只有A/Nanning/43/2014(H3N2)毒株抗原决定簇312位点发生突变,二硫键、酶活性位点、糖基化位点及耐药性位点均未发生变化;HA和NA蛋白晶体结构分析显示氨基酸突变位点主要发生在β折叠部位和无规则卷曲处. 结论 南宁市A(H3N2)亚型流感病毒株变异活跃,在HA基因和NA基因进化树上疫苗株明显滞后于南宁市流行株,抗原决定簇位点出现氨基酸的替换,但关于疫苗的预防效果尚需进一步验证.
关键词： A(H3N2)亚型流感病毒 血凝素 神经氨酸酶 蛋白结构 同源建模 -
人冠状病毒HKU1 Spike蛋白受体结合域结构预测
[目的]探索人冠状病毒HKU1(human HKU1 coronavirus,hHKU1-CoV)Spike蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白结构.[方法]利用已经发表的hHKU1-CoV Spike基因序列,通过蛋白建模获得该冠状病毒Spike空间结构,运用PDBsum平台进行蛋白结构分析.[结果]人冠状病毒HKU1-CoV Spike氨基酸序列(No.AGW27881.1) 535 ～673位可能存在RBD,二级结构显示该区域共有4个β折叠股、6个α螺旋,2个β-α-β单元.蛋白质空间结构分析显示RBD可分为核心区和Loop区.核心区由2个平行的β折叠股和4个α螺旋顺序链接组成,Loop区位于核心区外围,由ASN589-PRO673之间氨基酸构成1个含有3个边缘的柔性区域和2个反向平行的β折叠共同组成的腔隙结构,该区域可能是hHKU1-CoV与宿主受体作用的关键部位.[结论]hHKU1-CoV Spike蛋白与宿主受体作用的关键部位可能位于SER606～PRO673,这与已知结构的β冠状病毒相同区域在Loop区存在差异,但冠状病毒受体尚需进一步探索.
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树鼩白细胞介素-6的原核表达及其分子特征
目的 原核表达树鼩(tree shrew,ts)白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因,并分析tsIL-6蛋白分子特征.方法 以人、猴、啮齿类动物等IL-6 mRNA的共有序列作为查询序列,从树鼩cDNA数据库中进行本地blast,获得预测tsIL-6核苷酸序列,将其翻译成氨基酸序列,用MEGA 6软件进行核酸序列和氨基酸序列比对,绘制进化树.参考预测IL-6基因序列设计引物,PCR扩增IL-6基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a(+)-IL-6;转化感受态E.coli BL21(ED3),IPTG诱导表达,重组蛋白经14 KD透析膜梯度透析纯化;利用蛋白质在线数据库expasy进行蛋白质结构同源建模,并用SignalP sever预测tsIL-6的信号肽序列,经模板与预测模型的结构拟合来预测树鼩IL-6的gp130结合位点.结果 tsIL-6核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物有较高的同源性;重组表达质粒pET-28a(+)-IL-6经双酶切鉴定证明构建正确;重组表达蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后可见单一目的条带,浓度为0.2mg/ml;hIL-6和tsIL-6蛋白的空间结构较类似,tsIL-6的gp130结合位点Ⅱa位于A和C螺旋间,位点Ⅲa位于A和B螺旋的柔性链区及分子近C-端.结论 tsIL-6的核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物具有较高同源性,成功构建的重组原核表达质粒pET-28a(+)-IL-6,为后续IL-6相关的病理研究奠定了基础.
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Ⅰ型新德里金属β内酰胺酶的生物信息学分析
目的 应用生物信息学方法分析Ⅰ型新德里金属β内酰胺酶(New Delhi metallo-β-1actamase 1,NDM1)的基本性质,并与常见的β内酰胺类抗生素进行分子对接,在理论上研究NDM1对β内酰胺类抗生素和抑制剂的水解活性.方法 应用EMBOSS 6.3.1.1软件包的程序分析NDM1的基本性质,并分别利用SWISS-MODEL同源建模和PHYRE 2.0折叠识别法构建NDM1的空间结构,再运用Arguslab 4.0软件的dock模块进行β内酰胺类抗生素与NDM1分子对接.结果 NDM1共270个氨基酸残基,理论等电点为6.3,包含1个跨膜区,α螺旋占27％,β折叠占34.5％；与抗生素对接能量由低到高依次为氨苄西林、头孢拉啶、阿莫西林、头孢唑林、甲氧西林、美罗培南、亚胺培南、氨曲南、克拉维酸.结论 NDM1对氨苄西林催化效率高,对氨曲南催化效率低,克拉维酸对NDM1无抑制作用.
关键词： Ⅰ型新德里金属β内酰胺酶 同源建模 分子对接 -
M1毒蕈碱乙酰胆碱受体同源建模模板的选取及验证
目的:探讨不同同源模板所获得M1毒蕈碱乙酰胆碱受体模型的合理性及可靠性.方法:以牛视紫红素受体、人源β2-肾上腺素受体、M2胆碱受体和M3胆碱受体为模板,分别对M1胆碱受体进行同源建模;采用分子对接获得各M1胆碱受体同源模板与配体的互作模式,并与已报道的M胆碱受体晶体结构进行静态比对,得到佳M1胆碱受体同源模板;采用分子动力学模拟分析配体与关键残基距离的变化,对M1胆碱受体同源模板进行动态验证.结果:M2胆碱受体与M1胆碱受体的序列相似度较高,为67.9％;以Inactive M2胆碱受体为模板构建的M1胆碱受体(M1Rinactive-M2R)与其他晶体结构间RMSD值的均值低,为1.39 (A);M1Rinactive-M2R别构位点K392及E397残基侧链与结合口袋距离更近,与配体结合构象更匹配;分子对接结果显示,双位点别构激动剂VU0184670与M1Rinactive-M2R别构结合位点Y85、Y381的距离分别为4.8 (A)、6.8 (A),优于其他模型;分子动力学模拟后,配体与Q177残基的距离由7.4 (A)降至2.9(A),提示配体VU0184670向Q177方向偏转,与文献结果一致.结论:以Inactive M2受体结构为模板构建的M1胆碱受体模型为合理,更接近M1胆碱受体的晶体结构.本研究为M1胆碱受体药物开发提供重要工具,为其他GPCRs受体同源建模提供创新范式.
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简单节杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究
目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质.方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21 (DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化.结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27％;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y.突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致.结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础.
关键词： 3-甾酮-△1-脱氢酶 简单节杆菌 同源建模 定点突变 -
分子动力学模拟HPV(16,18)E6蛋白
目的:对人乳头瘤病毒HPV16,18中E6蛋白结构进行分子模拟和分析,寻找可以作为蛋白-配体相互作用的关键结构区域.方法:以HPV16 E6蛋白为模板,对HPV18 E6蛋白进行同源建模,对构建的HPV18 E6模型以及晶体结构模型HPV16 E6进行分子动力学模拟,通过微观上的loop环分析和宏观上的整体运动分析研究了HPV18 E6与HPV16 E6在溶剂环境下结构变化的异同.结果:发现靠近N端loop环在蛋白-配体结合过程中能介导控制配体、水、离子进出的“门控”的作用,解释了两个蛋白在水溶剂中的运动构象的变化.结论:本研究解释了HPV16 E6与HPV18 E6两个蛋白在溶剂中的运动机制,并发现了loop环在其中扮演“门控”的作用,解释了两个蛋白在水溶剂中的运动构象的变化,该发现能够为基于两个蛋白为靶点的药物设计提供理论依据.
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嗜酸热原体菌的超氧化物歧化酶的结构模建和进化踪迹分析
为考察来源于极端高温酸性环境中的超氧化物歧化酶,建立了一个由嗜酸热原体茵的sod基因编码的蛋白质的可靠三维分子结构,并对这个蛋白质进行进化踪迹分析识别出了11个踪迹残基?其中,残基Asn39,Gly105和Glu162的位置随机遍布整个结构,其余的残基却全部都明显地聚于一个靠近铁原子的子类当中?由此从在三维结构确认sod基因编码含铁的超氧化物歧化酶.此外,那些被识别的靠近铁原子的踪迹残基可能跟铁的绑定和催化功能直接相关?
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人腺病毒55型六邻体蛋白同源建模及B细胞抗原表位预测
目的 预测人腺病毒55型六邻体蛋白B细胞抗原表位.方法 使用DNAStar软件Protean模块,PSIPRED在线服务器和SWISS-MODEL在线服务器联合预测人腺病毒55型六邻体蛋白B细胞抗原表位.结果 构建了人腺病毒55型六邻体蛋白三级结构模型和预测得到5个候选的人腺病毒55型六邻体抗原表位.结论 成功预测人腺病毒55型六邻体蛋白B细胞抗原表位,为进一步研制疫苗和检测试剂奠定了基础.
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一种可特异识别Hmox1增强子的人工转录因子的构建
目的:设计一种可特异识别人血红素加氧酶-1基因(Hmox1)增强子的人工转录因子.方法:以锌指蛋白(ZFP)作为人工转录因子的DNA结合结构域,在人Hmox1增强子上选择一段序列作为锌指蛋白靶序列,提交Zinc finger tools 3.0设计得到该锌指蛋白的氨基酸序列,通过Swiss Model同源建模,对设计结果进行分析;将锌指蛋白与效应结构域相连组成完整的人工转录因子,用双荧光素酶报告基因检测系统检测其活性.结果:得到了能特异识别人Hmox1增强子的锌指蛋白氨基酸序列,同源建模结果显示其空间结构稳定,所构建的完整人工转录因子经双荧光素酶报告基因检测系统检测能特异上调报告基因的表达.结论:设计得到的人工转录因子经实验验证能特异识别人Hmox1增强子并有效上调报告基因的表达,为进一步构建可上调细胞核内Hmox1表达的人工转录因子奠定了基础.
关键词： Hmox1 人工转录因子 锌指蛋白 同源建模 双荧光素酶报告基因检测 -
利用生物信息学鉴定新发现的膜联蛋白亚家庭anx32
目的:对抗原基因cC1进行结构分析和初步功能研究.方法:利用网上生物信息学软件进行cC1的一级结构、二级结构分析,同源建模预测三级结构.白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)检测重组蛋白GST-anx32的抗凝血活性.结果:cC1在核酸水平和氨基酸水平均与膜联蛋白基因同源, 具有4个同源结构区域,且每一个同源区域均具有膜联蛋白的典型motif "G-X-G-T(38 residues)-D/E".抗凝血实验表明大肠杆菌表达的谷胱甘肽转移酶-cC1融合蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:抗原基因cC1具有膜联蛋白家族的典型特征,但与已知的31个亚家族氨基酸序列的同源性均低于48%,因此是一个新的膜联蛋白亚家族成员,命名为膜联蛋白32(anx32).为进一步研究其生理功能及核酸疫苗pcDNA3-γcC1诱导囊尾蚴细胞凋亡的分子机制打下了基础.
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儿茶酚氧位甲基转移酶基因rs4680多态位点与乳腺癌切除手术术后疼痛的相关性分析
目的 探讨儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-O-methyl transferase,COMT)基因rs4680多态位点与术后疼痛的关系,为个性化用药提供理论依据. 方法 择期全身麻醉行乳腺癌切除手术患者83例,年龄29～58岁,ASA分级Ⅰ、Ⅱ级.采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)对83例患者COMT基因rs4680位点进行基因型鉴定,根据基因类型将患者分为野生型Val/Val(VV,51例)、杂合型Val/Met(VM,23例)和突变型Met/Met(MM,9例);采用同源建模对突变前后蛋白质的三级结构进行预测,并对蛋白理化性质进行分析.采用统一的静吸复合麻醉方案进行术前麻醉,术后行患者自控静脉镇痛(patient controlled intravenous analgesia,PCIA),记录24h内镇痛泵的有效及无效按压次数,并用疼痛数字评分法(Numerical Rating Scale,NRS)评估不同基因型术后2、4、8、24h疼痛情况.结果 COMT基因rs4680突变对蛋白三级结构无明显改变,但对蛋白的部分理化性质有所影响.术后24 h内MM患者PCIA总按压次数明显高于VV患者和VM患者(P＜0.05),MM患者PCIA有效按压次数明显高于VV患者(P＜0.05),但3种基因型患者PCIA按压有效率差异无统计学意义(乃0.05).术后各时点3种基因型患者NRS评分比较,差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 COMT基因单个多态位点rs4680可能对乳腺癌患者术后疼痛的个体化差异影响不大.
关键词： 儿茶酚氧位甲基转移酶 基因多态性 同源建模 术后疼痛 乳腺癌 -
同源建模构建ABLSH3突变体及其与RIN1蛋白结合能力的分析
Bcr-Abl SH3与RIN1富含脯氨酸的序列结合,激活Bcr-Abl酪氨酸激酶活性,引起慢粒患者对伊马替尼耐药,为改变两者结合方式解决耐药问题,笔者对Bcr-Abl SH3结构域活性位点进行分析.PepSite2.0软件分析RIN1与Bcr-Abl SH3结合部位及特点,选择突变位点,VMD1.8.7和NAMD2.6软件动态模拟获取稳定的SH3突变体结构,PepSite2.0分析突变体和RIN1结合能力大小.两者结合部位位于SH3 90-118氨基酸位点,3种突变方式中双位点突变效果明显优于单位点及缩短的片段,单位点突变中并非所有被选择的位点突变后结合能力都提高,说明RIN1与SH3结合不仅依赖结合部位的特异氨基酸,其周围的氨基酸对维持两者的结合有着至关重要的作用.
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不对称催化醇脱氢酶的生物信息学分析
目的 从生物信息学角度分析克隆到的醇脱氢酶(ADH).方法 根据ADH的氨基酸序列,应用多种生物信息学工具对其进行蛋白序列分析,预测其信号肽、跨膜区、疏水性、二级结构,并对其三维结构进行同源建模预测和分析.结果 ADH是348个氨基酸组成的较为稳定的酸性蛋白,无信号肽结构,有明显的跨膜结构域,呈疏水性.二级结构大量的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,而延伸链则散布于整个蛋白质中,高级结构呈现较为致密的球体.结论 建立了较为完整可靠的ADH信息学研究,对中药活性成分的获取及作用机制进行了新的尝试,为后期研究其生物学功能和构效关系奠定了基础.
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泽泻醇类化合物调血脂作用及分子机制的研究
目的：研究泽泻调脂效应物质泽泻醇类化合物23-乙酰泽泻醇 B、24-乙酰泽泻醇 A 对高脂小鼠调血脂作用及其分子机制。方法建立高脂小鼠模型,检测泽泻醇给药后的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),检测了脂代谢关键酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的活性,通过同源建模得到 LCAT 分子结构,采用分子模拟进行了泽泻醇与LCAT 相互作用的研究。结果泽泻醇降低 TG、TC 水平,升高 HDL-C 水平,起到调血脂作用。泽泻醇降低 LCAT 活性,与LCAT 的结合区域在 Leu201~Phe305范围内。结论泽泻醇升高 HDL-C 的机制可能非通过提高 LCAT 活性实现,Leu201~Phe305区域可能为其抑活位置。Ile227、Arg217、Gly2293个氨基酸可能是2者与该蛋白相互作用的关键氨基酸残基。
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吸水链霉菌5008中谷氨酸脱氢酶SHJG_7666的性质表征
谷氨酸脱氢酶可在NAD(P)H辅因子协助下催化α-酮戊二酸和谷氨酸之间的转化,是氮代谢途径的关键酶.基于基因组BLAST分析预测,吸水链霉菌5008(S5008)中SHJG_7666 是谷氨酸脱氢酶的编码基因.本研究在大肠杆菌中对SHJG_7666蛋白进行了异源表达,并对其酶学性质进行了表征.系统发育树及同源建模结构分析显示SHJG_7666 具有保守的谷氨酸、α-酮戊二酸结合域以及经典的GXGXXG二核苷酸结合基序,其活性中心由Lys60,Lys78,Asp120催化功能位点及Ser36,Gly38,Gln119,Asp166,Asn300,Ala330谷氨酸、α-酮戊二酸结合位点组成,属于Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶家族;体外生化实验显示,其催化α-酮戊二酸转化为谷氨酸的适pH和温度分别为7. 5和37 ℃,对底物α-酮戊二酸Km为(25. 3 ±9. 1 )μmol/L, kcat为(3 ±0. 8)×10 -5s-1.本研究验证了SHJG_7666谷氨酸脱氢酶的催化功能,揭示了其活性中心关键氨基酸残基,为利用蛋白质工程手段对SHJG_7666进行分子设计以提高其催化活力,进一步利用代谢工程手段对宿主氮代谢进行调控奠定了基础.
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Cav1.2钙离子通道三维结构的同源建模及其应用
目的：构建心肌Cav1.2钙离子通道三维结构模型，检验模型的准确性与可靠性。方法利用 SWISS-MODEL 同源建模服务器，对豚鼠心肌细胞Cav1.2通道α1亚基进行同源建模，建模结果提交至加州大学蛋白质结构在线检测服务器进行检测评估，并对结构模型进行打分。利用MOE软件分子对接程序模拟阻断剂或药物与Cav1.2通道模型的结合，进一步验证通道模型的准确性与可靠性。结果在SWISS-MODEL服务器上搜寻到的模板序列 Cav1.1α1 S 与目标序列Cav1.2α1 C均为L型钙通道，序列比对结果显示其同源性高达71.5％，选择自动模式（automated mode）进行同源建模。L型钙通道阻断剂维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓能结合到Cav1.2通道三维结构模型的特定区域，而钠通道特异性阻断剂河豚毒素并未与该模型相结合，中药有效成份白花前胡甲素和小檗碱与该模型也有一定的结合。结论成功构建了心肌Cav1．2钙离子通道三维结构模型，为后续研究提供了可靠样本，也为同源建模在研究离子通道三维结构预测中的应用奠定了基础。
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日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶同源建模及功能分析
目的：对日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）进行结构及功能分析。方法基于结构序列比较利用Swiss-Pdbviewer构建了日本血吸虫的TGR同源结构模型，并对模型进行结构评估；分析日本血吸虫TGR与底物结合时可能的位点，比较这些位点在不同来源TGR中的异同。结果日本血吸虫 TGR结构在 PROCHECK评估中被证实可靠；位点比较分析表明NADPH、GDS结合区是保守的位点；GSH结合区存在特异性。结论作用于GDS、NADPH结合区的其它来源的TGR抑制剂可能对日本血吸虫TGR也有作用；GSH结合区是设计寄生虫TGR特异性抑制剂的潜在靶点之一；TGR的C末端对电子传递起着重要作用并可能参与底物的结合，因而阻断日本血吸虫TGR的C末端摆动的抑制剂将可能有效地抑制日本血吸虫TGR活性。
关键词： 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶 日本血吸虫 同源建模 功能分析
