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简单节杆菌催化甾体化合物C1,2位脱氢规律的研究
目的:研究不同基团的甾体底物在不同反应体系中的生物脱氢规律及细胞壁、细胞膜对生物转化的影响.方法:将研究底物置于4种不同的反应体系中,即采用普通直接转化、双液相转化、破碎细胞转化和原生质体转化方法,测定各甾体的熔点、比旋度、吸光系数等理化性质,并通过非线性拟合方法建立了甾体化合物C1,2位脱氢转化率与其理化性质之间变化规律的数学模型.结果和结论:保证细胞的完整性对1,2,位脱氢转化至关重要;甾体底物在普通直接转化中,脱氢转化率按由高到底排列依次是醋酸可的松、普氏脱溴物、醋酸氢化可的松、甲睾酮、睾丸素、4-雄烯二酮和可的松,RSA不转化;4种反应体系按其甾体化合物转化率高低的排序依次是普通直接转化、双液相转化、破碎细胞转化和原生质体转化(醋酸氢化可的松除外).在同一种反应体系中,数学模型显示不同底物的熔点和吸光系数对其转化率有着正向促进作用,而比旋度对其转化率具有负向抑制作用.
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简单节杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究
目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质.方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21 (DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化.结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27％;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y.突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致.结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础.
关键词： 3-甾酮-△1-脱氢酶 简单节杆菌 同源建模 定点突变 -
促溶剂对生物催化甲基睾丸素C1.2位脱氢的影响
研究促溶剂在简单节杆菌(Arthrobacter simplex AS 1.94)催化甲基睾丸素C1.2位脱氢过程中对甾体转化结果的影响.在简单节杆菌催化甲基睾丸素C1.2位脱氢过程中加入不同的亲水性有机溶剂,以甲基睾丸素的转化率为指标,选择适的亲水性有机溶剂并确定其佳的添加量,同时研究不同的促溶剂配比对转化的影响.结果发酵液中单一的添加4%的甲醇时底物甲基睾丸素的转化率可达80%,添加1‰的Tween-80可使转化率达到46%,两者作为混合促溶剂同时加入,对转化率的提高更明显,达到81%.因此选用4%的甲醇和0.1‰的Tween-80作为混合促溶剂对整个生物转化过程有良好的促进作用.
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简单节杆菌17α-羟基-16β-甲基-孕甾-4,9(11)二烯-3,20-二酮脱氢酶产酶条件研究
目的优化简单节杆菌17α-羟基-16β-甲基-孕甾-4,9(11)二烯-3,20-二酮(简称HMPDD)脱氢酶产酶条件.方法采用摇瓶培养方法,考察培养基组成及发酵条件对HMPDD转化率的影响.结果较佳产酶培养基为:葡萄糖0.4%、玉米浆1.2%、KH2PO40.2%、蛋白胨0.3%.较佳产酶条件为:培养基初始pH7.0;接种量20%;摇瓶装量100mL/250mL三角瓶;接种后4h内添加0.05g/L底物作为诱导物对产酶有利;添加10-4mol/L Co2+和Mg2+,可使酶活分别较对照提高12.9%和6.1%;菌体培养12h时酶活达大值,为24.46μmol/g·min.结论通过培养基组成及产酶条件的优化,酶活力有较大幅度的提高.
